Dr.Kaan AYDOS

Y kromozomu üzerinde spermatogenezden sorumlu 3 adet bölge vardır: AZFa, AZFb ve AZFc (DAZ) bölgeleri. Bu bölgelerde de çok sayıda gen yer alır ve spermatogenezi sağlarlar. Önce DAZ bölgesi ve buradan sorumlu genler tanımlandı. Arkasından diğer bölgeler incelendiler. Şimdi, bu 3 bölgenin dışında, AZFc'nin distal komşuluğunda başka bir bölgenin varlığı üzerinde tartışılmaktadır. Aşağıda DAZ genleri ve bunu takiben diğer bölgeler, test yapımıyla da ilişki kurularak kısaca özetlenmeye çalışılmıştır.

Erkek infertilitesinde Y kromozomunun önemi ilk olarak 1976'da Tiepolo ve Zuffardi'nin yayınladıkları bir araştırma ile başlamıştır. Burada 1170 subfertil erkekte karyotip analizi yapılmış ve azoospermi bulunanların 6'sında Y kromozomunun uzun kolunda bir kayıp olduğu gözlenmiştir. Bunun üzerine yazarlar, Y kromozomunun uzun kolunun, spermatogenezin olabilmesi için gerekli bazı gen loküslerini içerdiğini ileri sürmüşlerdir. Bu çalışmayı takiben yapılan çok sayıdaki araştırma artık Y kromozomu üzerinde bazı genlerin spermatogenezde rolü olduğunu açıkca ortaya çıkarmıştır. PCR tekniğinin de yaygınlaşmasıyla Y kromozomu üzerindeki genleri gösteren bir harita yapılmıştır.

Neticede anlaşıldı ki, bu kromozom üzerinde spermatogenez ile ilgili 3 adet bölge bulunmakta ve bu bölgelerde de çok sayıda gen görev yapmaktadır. 1993'den itibaren, Reijo, Ma, Lahn vd. araştırıcılar bu bölgelerde yerleşmiş DAZ (deleted in azoospermia), RBM ve benzeri gen ailelerini tanımladılar. Hepsi bir araya getirilince, bu bölgelerde bulunan genlerin delesyonlarında (silinmelerinde, eksikliklerinde) ortaya çıkabilecek germinal aplaziden oligozoospermiye kadar değişen testis biyopsisi bulguları, yani fenotipleri, de ortaya çıkarılmış oldu. ICSI sonuçları incelendiğinde anlaşıldı ki, genlere ait delesyonlar erkek çocuklara da geçmekteydi.

Ancak, Y kromozomunda bulunan ve spermatogenezden sorumlu bu genlerin somatik ve/veya germinal hücrelerde dağılımı mozaik bir yapı göstermektedir. Yani, genetik araştırma yapmak için lökositler kullanıldığında herhangi bir delesyon bulunmazken, aynı şahsın germ hücrelerinde delesyon bulunabilmekte ve bu delesyon durumu çocuğa da nakledilebilmektedir. Diğer yandan, testislerde bazı seminifer tubüller germinal aplazi gösterirlerken, diğerleri normal ya da maturasyon arresti durumunda da bulunabilmektedirler. O halde, aynı testiste seminifer tubüller arasında genetik materyal taşıma bakımından farklılıklar bulunmaktadır, yani bir mozaizm söz konusudur. Bu da neden delesyon tayininde kan örnekleri ile germ hücreleri kullanıldıklarında farklı sonuçlar gelebileceğini açıklamaktadır. Yani lökositler ya da fibroblastlar kullanılarak genetik analiz yapıldığında, Y delesyonu bulma oranları daha düşük olmaktadır, çünkü germ hücrelerinde meydana gelen delesyonlar, diğer dokulardan bağımsızdır. Zaten somatik hücrelerdeki defektler doğacak çocuğa geçirilmezler. Şimdi artık DAZ delesyonlarının görülmesinde germ hücreleri mozaizm sıklığının hesaplanması gündeme gelmiştir.

Günümüzde çoğu delesyon çalışmaları kan hücrelerindeki DNA'ları kullanarak yapılmıştır ve yapılmaktadır. İlk olarak 1995'de Reijo tüm Y kromozomunu kaplayan 118 markır kullanarak PCR yöntemiyle azoospermik erkeklerde genetik araştırma yapmış, sonuçta %13'ünde delesyonların varlığına işaret etmiştir. Bu genlerin bulunduğu bölgeye DAZ (deleted in azoospermia) adını vermiştir. Daha sonra bu bölge için AZFc (2000-3000 kilobases) terimi kullanılmaya başlanıldı. Enteresan yanı, delesyonlu erkeklerin erkek akrabalarının hiç birisinde delesyon gösterilmedi.

Ancak yazarlar daha fazla markır kullanılarak aynı bölge üzerinde başka delesyonların da bulunabileceğini düşünerek araştırmalarını genişlettiklerinde, DAZ bölgesindeki genleri tanımlamak için 47 yeni markırın daha bulunduğunu ortaya çıkardılar.

DAZ bölgesinde bulunan genlerin delesyonları ile testis biyopsileri karşılaştırıldığında, değişik fenotiplerin ortaya çıkabileceği anlaşılmıştır. Delesyon bulunan azoospermik erkeklerin bazılarında, tamamen germinal aplazi olmasına rağmen, bazı tubüllerde spermatozoa bulunabilmektedir. Demek ki DAZ bölgesi komplet spermatogenez için kesinlikle gerekli değildir. Burada genetik modifiyerler, mozaizm ya da mikro-ortama ait farklı etkileşimler de söz konusu olabilir.

DAZ bölgesindeki delesyonlar azoosperminin yanı sıra %6 oranında oligozoospermiye de yol açabilirler.

Çalışmalar açıkca göstermiştir ki, oligozoospermik olgularda lökositlerde saptanan delesyonlar spermatozoada da bulunabilir ve ICSI ile erkek çocuğa aktarılabilir.

DAZ bölgesinde hangi genlerin bulunduğu exon-trapping yöntemiyle araştırılmıştır. İlk olarak Duyk 1990'da, DAZ bölgesi üzerinde 3.5 kb'lık bir testis-spesifik band elde etmiş ve bu genlere ait problar kullanarak infertil erkeklerde delesyonlarını ortaya koymuştur. Bunu takiben, DAZ bölgesinde bulunan daha çok sayıda gen de tanımlanmıştır. Bu bölgede bulunan sorumlu genlere ait aminoasit dizileri incelendiğinde, bu aminoasit sekanslarının tek bir RNA-bağlayan reseptör içerdikleri, aminoasit dizilerinin ise çok sayıda tekrarlar yapabileceği anlaşılmıştır. Yani, bu genlerin kromozom üzerinde çok sayıda kopyaları bulunabilir ve DAZ bölgesinde delesyon saptanan infertil erkeklerde bunların tümü birden kaybolmuştur. Ayrıca, DAZ genlerinin 3 numaralı otozomal kromozom üzerinde bir de homoloğu bulunmuştur (DAZL) ve buradan da DAZ genleri yapılabmektedir. Eksperimental çalışmalarda DAZ homoloğu genlerin yokluğunda germ hücrelerinin tamamen yokluğundan, düşük konsantrasyonda varlığına kadar değişik fenotipler elde edilmiştir. İnanılmaktadır ki, delete olan DAZ genlerinin sayısı germ hücre sayısını belirlemektedir. O halde bir şahısta DAZ delesyonu varsa bu şahısta total germ hücre yokluğu ya da maturasyon arresti ya da az sayıda da olsa germ hücresi bulunabilecektir.

Sonuç olarak, DAZ bölgesi infertilite için bir markır olup, delesyonu infertiliteye yol açar.

Farelerde önce DAZL genleri ortadan kaldırıldığında germ hücreleri hemen hiç gelişmemektedir. Ama bunlara sonradan insan Y kromozomu DAZ genleri verildiğinde, çoğu tubüllerde germ hücrelerinin oluştuğu gözlenmiştir. Demek ki insan Y kromozomu DAZ genleri, eksperimental olarak DAZL genlerinin yerini tutabilmektedir. Bu gözlemlerde DAZ'ın germ hücre sayısını belirlemede rolü olduğunu ortaya koymaktadır.

DAZ genlerinin yaptığı proteinlerin ne zaman ve hangi hücrelerde rol aldığı da araştırılmıştır. Bu proteinlerin ilk olarak fötal gonositlerin nukleus ve sitoplazmasında bulundukları gösterilmiştir. Adultlarda ise en fazla spermatogoniumların nukleusunda bulunmaktadırlar. Mayoz sırasında ise primer spermatositlerin sitoplazmalarına geçmektedirler. Demek ki, DAZ genleri mayoz öncesi germ hücrelerinin nukleus ve sitoplazmasında fonksiyon görmekteler, mayoz sonrası hücrelerin ise özellikle sitoplazmalarında çalışmaktalar. O halde, DAZ genleri erken germ hücrelerinin gelişmesinde, sonraysa mayozun sürdürülmesinde görev almaktadırlar.

Y delesyonlarının saptanmasında hangi genler için hangi markırlar kullanılmalıdır

Y kromozom analizinde önemli olan, PCR sırasında delesyonu ortaya koyacak en ideal markırın kullanılmasıdır. Yani incelenecek genlerin iyi tanımlanması ve test sırasında bunlara uygun markır probların kullanılması gerekir.

Lee bu amaçla, tüm Y kromozomunu analiz etmek için 23 markır bildirmektedir.

• sY13 psödoakrozomal bölge için bir markır olup, tüm analizlerde kullanılmalıdır.

• sY14 SRY geni için bir markırdır.

• sY238 ZFY bölgesi için markırdır.

• TSPY (sY200) perisentromerik bölge, sY78 ise sentromer için markırlardır.

• DFFRY, UTY, TB4Y, sY83 ve sY85 AZFa bölgesindeki genler için markırlardır.

• EIF1AY, RBM1, RBM2, sY142, sY143 ve sY152 AZFb bölgesini gösterir.

• sY221, sY158, sY254, sY283, sY242 ve sY202 AZFc ya da DAZ bölgesi için markırlardır (sY254 ve sY283 DAZ geni exonlarını belirler, sY221 ve sY242 DAZ geni intronlarını belirler).

• sY160 Y kromozomu uzun kolunun heterokromatin yapısını belirler.

Delesyon analizlerinin sonuçları

Değişik ülkelerden değişik laboratuvarların yaptıkları çalışmalarda, o populasyon içerisinde AZFa, AZFb ve AZFc delesyonlarına ait farklı sıklıklar bildirmektedirler.

Lee'nin çalışmalarına göre oligozoospermili erkeklerde AZFa delesyonuna %4.2 kişide rastlanılmaktadır. %1.4 AZFb delesyonu, %2.8 ise AZFc (DAZ) delesyonu göstermektedir. Oysa AZFa bölgesinin delesyonları en ileri bozukluk olarak bilinmekte ve Sertoli cell only sendromu ile kesin birlikteliği savunulmaktadır. Bu sonuçlara göre AZFa bölge delesyonlarında da oligozoospermi görülebilmektedir.

Azoospermik erkeklerde delesyon görülme sıklığı, oligozoospermiklerden çok daha fazladır. Delesyonu olan azoospermiklerin sadece %7.6'sında delesyon AZFc bölgesine ait olup, geri kalanında AZFb delesyonu sorumludur.

Bütün bu sonuçlara rağmen, AZFc bölgesinin daha distalinde bulunan bir gen grubunun daha spermatogenezden sorumlu olabileceği şüphesi mevcuttur.

Y kromozomu üzerinde çok sayıda gen bulunmuş olmasına rağmen, daha tanımlanmamış çok sayıda başka gende bulunabilir. Bunlardan biri DAZ bölgesinin distalinde bulunması muhtemel gen grubudur. Belki bu genler DAZ bölgesi genlerinin ekspresyonundan sorumludurlar.

Lee DF, Castillo MB, Turek PJ, Pera RA: Y chromosome deletion analysis and the DAZ genes. Andrology 2000. Proceedings of the 1st european congress of andrology. Collana di studi abruzzesi, L'Aquila, 2000'den özetlenmiştir.