d) ÜYT'de Kullanılacak Sperm Hücre Fonksiyonlarının Değerlendirilmesi: Bir infertilite olgusunun tedavisinde amaç; sperm ve oositin gerektiği şekilde birleşerek fertilizasyonunun sağlanması ile oluşacak embriyonun normal implantasyonu ve devamında sağlıklı bir gebelikle çocuğun doğmasıdır. Burada androloğun rolü bozulmuş fertilizasyon proçesi içinde hangi kademede problemin geliştiğini ortaya çıkararak, gerekli önlemleri almak ve sorunu tedavi etmektir. Embriyonun implantasyonundaki bozuklukların sperme ait defektlerden de gelişebileceği ortaya konulmuştur. Özellikle, spermatozoaya ait sentrozom defektlerinin oosit fertilizasyonunda arrest oluşturduğu (27) ve kötü kaliteli spermler ile yapılan çalışmalarda embriyo gelişiminin bozulduğu ve implantasyon şansının azaldığı (28) açık olarak gösterilmiştir. Bu nedenle infertilite olayında spermin hangi evrede rol oynadığının açığa çıkarılması son derece önemlidir. Fertilizasyon kademelerini araştıran testler şunlardır (tablo 4) (29):

Servikal mukusun penetrasyonu: Postkoital test, İn vitro sperm-servikal mukus etkileşim testleri (Tru-trax, Penetrak, SCMC)

Kapasitasyon: IVF, SPA, Mannoz reseptör tayini

Akrozom reaksiyonu: IVF, SPA, Akrozom reaksiyon testleri

Zona pellusida bağlanması: IVF, HZA

Zona pellusida penetrasyonu: IVF

Oosit-sperm füzyonu: IVF, SPA

Tablo 4. Sperm'in oositi fertilizasyonu sırasında geçirdiği fizyolojik evreler ve bunları araştıran testler. IVF: in vitro fertilizasyon, SPA: sperm penetrasyon testi, HZA: hemizona testi

Androloğun yukarıda sayılan testler hakkında bilgi sahibi olması ve gerekli olgularda değerlendirime tabi tutması, uygulanacak tedaviyi de yönlendirecektir. Zona pellusidaya bağlanma defekti bulunan bir spermin IUI veya IVF-ET işlemlerine alınması hiç kuşkusuz tedavide başarısızlıkla sonuçlanacaktır. Bu olgularda doğrudan ICSI ile gebeliğin sağlanma şansının bulunduğu açıktır. Benzer şekilde, yanlış uygulamalar ancak uygun testlerin yapılması ile önlenilebilir.

e) Sperm Hazırlama Yöntemleri ve Uygun Olan ÜYT'nin Seçimi: Genelde uygulanan üremeye yardımcı teknik yöntemleri IUI, IVF-ET ve ICSI'dir. Uygulanacak metod spermiyogram bulguları ve sperm fonksiyon testleri sonuçlarına göre seçilmelidir. 36 yaş altındaki kadınlarda 3 siklus uygulanımını takiben IUI'un başarısı >%40 dır (30). Swim up ile ejakulatın hazırlanmasını takiben >10x106/ml spermatozoa ve >%40 motilite içeren olgularda IUI ile başarılı sonuçlar alınabilir (31). Ancak, motil sperm sayısı <106 olduğu zaman gebelik oranı %3'ün altına düşmektedir. IVF için kullanılacak spermlerin ise >%30 ileri motilite ve >%30 normal morfoloji gösteren >5x106/ml spermatozoa içermesi önerilir (32). İnseminasyon dropleti içinde ise oosit başına 2x104 - 1x105/ml motil spermatozoa eklenmesi yeterlidir. Spermin kalitesine göre (immotil, aglütine, anormal spermlerde) bu sayı 5x105/ml'ye kadar yükseltilebilir (33).

ICSI için ise sperm sayısında bir kriter yoktur. Azoospermik olgularda bile testislerden elde edilen spermatozoalar, hatta spermatid kullanılarak gebelik elde edilebilmektedir. Bütün bu uygulamalarda başarılı olmanın en önemli koşullarından biri sperm hücresinin canlı olmasıdır. Oositi fertilize edebilecek kalitede bir spermi ayırt etmenin en iyi yöntemi sperm motilitesinin ve sperm membran bütünlüğünün hipoosmotik ortamda şişme (HOS) testi veya eozin- Y vitalite boyama testi ile gösterilmiş olmasıdır. Motil olmayan spermlerin canlı oldukları ortaya konmuşsa bunların kullanılması ile sağlıklı ICSI gebelikleri elde edilebilir. Oysa immotil spermlerin IUI ya da IVF gibi diğer ÜYT'de kullanılması başarılı olmayacaktır. Bu nedenle, ÜYT uygulanması kararı verilmiş olgularda, taze ejakulatın ve hastanın kliniğine göre en uygun sperm hazırlama yönteminin seçilmesi hastayı takip eden doktorun özellikle üzerinde durması gereken bir koşuldur. Örneğin, seminal parametreleri orta derecede ve ileri derecede bozulmuş erkeklerde gradiyent sistemi ile sperm hazırlanıp ÜYT uygulandığında siklus başına gebelik oranları sırasıyla %43.5 ve %7.1 bulunurken (34), swim up ile hazırlanmış örneklerde gebelik oranları ise orta kalite ejakulatlarda %5.9'da kalmaktadır. Demek ki, sperm hazırlama yöntemleri spermin kalitesine göre seçilmelidir.

f) Mikrocerrahi ile TESE ve MESA Uygulamaları: Azoospermiye erkek infertilitesi olguları arasında %10 oranında rastlanılmaktadır. Bunların büyük kısmında etyoloji testiküler yetmezliğe bağlıyken, %20'sinde bilateral obstrüksiyon sorumludur. Genel olarak değerlendirildiğinde ise infertilitede seminal kanallara ait obstrüksiyon sıklığı %7 civarındadır (35). Geçirilmiş skrotal veya inguinal operasyon ya da tekrarlayan genital enfeksiyon hikayesi bir obstrüksiyonun varlığını düşündürmelidir. Bu hastalarda testis volümü normal olup, FSH ve LH hormon düzeyleri de yine normal sınırlarda bulunur.

İnfertil erkek populasyonunun %1-2'sinde konjenital bilateral vaz deferens agenezi (CAVD) söz konusudur. İnfertilite nedeniyle tetkik edilen erkeklerin yaklaşık %20'sinde ultrasonografik veya vazovezikülografik incelemeler ile ejakulatör kanallara ait fonsiyonel ya da mekanik obstrüksiyon yapması muhtemel bir anomali saptanırken, bunların %4'ünde ejakülatör kanallarda parsiyel bir obstrüksiyonun varlığı söz konusudur (36). Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarında ejakulatın tamamını veya büyük kısmını prostat sekresyonu oluşturur. Ejakulat volümü 0.5-1 ml, pH ise 5.5-6.5 civarındadır. Koagulasyon oluşmayıp, semende früktoz negatiftir. Bu nedenle, vaz deferenslerin palpe edildiği ama seminal volümün azaldığı ve asitleştiği azoospermi olgularında komplet bilateral ejakulatör kanal darlığından şüphelenilmelidir. Parsiyel tıkanıklıkların kliniği ise değişkendir. Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarının tedavisinde transrektal ya da transperineal kist aspirasyonu, transuretral endoskopik rezeksiyon veya seminal kanalların yıkanması kullanılan metodlardır.

Seminal parametreleri ileri derecede bozuk olan erkeklerin %20-25'inde ise epididimal oligozoospermi bulunmaktadır (37). Bu durum, epididim içinde skar dokusu oluşumuna neden olan klinik ya da subklinik geçirilmiş enfeksiyonlara bağlanmaktadır. Skar dokusu epididimal tubulülere bası yapmakta ama bir miktar sperm çıkışına da izin vermektedir. Son yıllarda seksüel geçiş gösteren hastalıkların artması ile bu oranın daha da yükselmesi beklenmektedir. Geniş serili çalışmalarda, sperm konsantrasyonunun 5 milyon/ml'den düşük, %20'den az motilite ve %25'in altında normal formda sperm bulunan olguların %49'unda testis biyopsilerinde normal spermatogenez saptanırken epididimal bir patoloji de eşlik etmektedir. Spermatogenezin ve epididimlerin her ikisinin de normal olduğu olgular sadece %4 oranındadır. Geri kalanlarında ise spermatogenezde bir bozukluk söz konusudur. Epididimal oligozoospermi olgularının tedavisi mikrocerrahi olup, epididimolizis ya da vazoepididimal anastomozlar uygulanabilir. Sonuçları oldukça başarılıdır. Değişik etyolojilere bağlı gelişebilen vazal ya da epididimal obstrüksiyonların mikrocerrahi ile tedavileri neticesi %38-96'sında anastomoz açıklığı ve %19-82 arasındada spontan gebelik oranları bildirilmektedir (38). Sonuçlardaki değişkenlik obstrüksiyonun seviyesi ve süresi, epididim fonksiyonları, tekrarlayan genital enfeksiyonların varlığı ve antisperm antikor gelişimine bağlanabilir.

Obstrüktif azoospermi olgularında yukarıda bahsedilen tedavileri takiben bir düzelme sağlanamamışsa üremeye yardımcı teknikler kullanılmalıdır. Ejakulattan yeterli sayı veya kalitede sperm elde edilemediği olgularda testisden ya da epididimden alınan spermler ICSI işleminde kullanılarak olguların sırasıyla % 33.3 ve %44.3'ünde gebelik sağlanılabilir (39).

Nonobstrüktif azoospermi'ye ise değişik faktörler yol açabilir: maturasyon arresti, germinal aplazi (Sertoli cell only sendromu), kriptorşidizm, kemoterapi veya Klinefelter sendromu bunlar arasında sayılabilir. Testiküler yetmezlikli bu olguların yaklaşık %50'sinda testislerden spermatozoa ekstrakte edilebilmektedir (40). Geri kalanlarında ise yuvarlak spermatid nukleusu (ROSNI) veya değişik evrelerde spermatidler kullanılarak ICSI yapılabilmektedir (41). ICSI'de kullanılabilecek en ideal spermatid evresi uzamış (elongated) ve matür spermatidlerdir (42). Bununla birlikte, uzamakta olan (elongating) ya da yuvarlak spermatidler kullanılarak da fertilizasyonun başarılması mümkündür.

Hoffman veya Nomarski optikleri kullanılarak bile haploid yuvarlak spermatidleri diploid spermatositlerden, spermatogoniumlardan, lökositlerden, eritrositlerden ya da Sertoli hücre nukleusundan ayırt etmek her zaman kolay olmamaktadır. Bu amaçla bazı kriterler getirilmiştir (43). Yuvarlak spermatidlerin daha küçük olmaları (6.5-8 ) ve çıkıntı yapmış akrozom veziküllerinin görülmesi, belirgin nukleusları ile bunu çevreleyen sitoplazma zonu bunların spermatogoniumlardan, spermatositlerden ya da lenfositlerden ayırt edilmesinde yardımcı bazı kriterlerdir. Bununla birlikte, ikinci mayoz bölünmesini yeni tamamlamış bir spermatidde henüz akrozom yapısı gelişmediği için, Golgi fazı spermatidleri özellikle küçük lenfositlerle karışabilmektedir. Belirgin nukleolusu ve transparan, düz sınırlı görünümleri ile Sertoli hücre nukleuslarını görebiliriz. Bütün bu kriterlere rağmen bir yuvarlak spermatidin canlı olup olmadığına ya da genomik yapısının normal olup olmadığına, hücreyi boyamadan veya parçalamadan karar vermek imkansızdır. Tek kriter mikropipet içine aspire edildikten sonra spermatidin lizis olmadan canlılığını sürdürdüğünün gözlenmesidir. Komplet spermatogenez bozukluğu gösteren testislerin sadece %10'unda yuvarlak spermatid bulunabilmektedir. Daha önceki tahlillerinde azda olsa spermatozoa görülmüş olan olgulardan elde edilen spermatidler kullanılarak yapılan ICSI işleminden elde edilen başarı, şiddetli spermatogenez defekti bulunan olgulardakine göre çok daha düşüktür. Yuvarlak spermatid kullanılacak olgularda işlemin etkinliğinin ve Y kromozom delesyonlarının genetik geçiş risklerinin mutlaka önceden çiftlere izah edilmesi gerekmektedir.

TESE işlemi sırasında spermatid bulunduktan sonra başka hücre aranmasına son vererek bu spermatidin kullanılması ya da araştırmaya spermatozoa bulununcaya kadar devam edilmesi konusu halen tartışılmaktadır. Spermatid bulunan olgularda mutlaka spermatozoada bulunabileceğini savunan araştırmacıların yanı sıra, spermiyogenez arresti olgularında Sertoli hücreleri ile bağlantılarının kesilmesi neticesi daha ileri maturasyon gösteremeyen spermatidlerin spermatozoa olmasa da elde edilebileceğini savunan bilim adamları da bulunmaktadır (44, 45). Çalışmalar, testis dokusunun fazla travmatize edilmesinin ileride atrofi yapabileceğini ve başka uygulamalarda kullanılamaz hale getirebileceğini ortaya koymuştur (46). Bu nedenle hastanın durumu, önceki biyopsileri ve kadın faktörü de göz önüne alınarak bu işlemin sınırına karar verilmesi daha uygun olacaktır.

TESE işlemi sırasında mutlaka skrotal eksplorasyon da yapılmalıdır. Bu sırada vazal ya da epididimal bir obstrüksiyonun varlığı teşhis edilebilirse, mikrocerrahi olarak obstrüksiyon giderilmeli ve uygun anastomoz teknikleri kullanılarak sperm kanallarının bütünlüğü sağlanılmalıdır. Eğer epididimal mikroaspirasyonla sperm elde edilebilecekse, öncelikle bu yapılmalı, yeterli kalite ve kantitede sperm elde edilemiyorsa testislerden doku çıkarılmalıdır. Daha distal obstrüksiyonlarda vaz deferensten aspire edilen sperm de kullanılabilir. Daha önce yapılmamış ise bu olgularda aynı seansta testis biyopsisi de alınmalıdır.

İnfertilite olgularında tanısal amaçlı testis biyopsisi artık uygulanmamaktadır. Proksimal seviyede bir obstrüksiyon ya da nonobstrüktif nedenli azoospermi bulunan erkeklerde skrotal eksplıorasyon yapılmalı, aynı zamanda hem epididimlerin durumu ve vazın açıklığı kontrol edilmeli, hem de MESA veya TESE ile spermatozoa araştırılmalı, bulunursa ileride ICSI'de kullanılmak üzere dondurularak saklanılmalıdır. Gerekirse rekonstrüktif mikrocerrahiye geçilmelidir. Bu sırada testis biyopsisi de alınmalı ve infertilite ile eş zamanlı bulunabilecek başka patolojilerin varlığı, azoosperminin derecesi ve infertilite nedeni olabilecek patolojiler araştırılmalıdır. Buradan da anlaşılacağı üzere, TESE veya testis biyopsisi sadece doku çıkarmak değil, beraberinde ek girişimleri de gerektirebilecek önemli bir uygulamadır. Bunun eğitimini almış uzmanlar, androloglar, tarafından yapılması uygun olur. Diğer yandan, sonuçta ortaya çıkabilecek komplikasyon veya yan etkilerin de tedavisi sorumluluk gerektirir.

TESE işlemi operasyon mikroskopu altında yapılmalıdır (Mikrocerrahi-TESE). Testisin damarlanmasının en az olduğu bölgesi alt kutup iç, dış ve ön yüzü ile üst kutup iç ve dış bölgeleridir. Mikroskop ile damarlanmanın olmadığı alanlardan ince (tercihan göz ameliyatlarında kullanılan) bir bistüri ile kesi yapılması uygun olur. Testis dokusu arasında da yine damarsız hatlardan diseksiyon yapılarak ilerlenilmelidir. TESE işleminde seminifer tubülülerin mikrodiseksiyonla eksize edilmeleri en ideal olan yaklaşımdır. Fibrotik ve kollabe, ince tubülü alanlarının yanında, dolgun ve daha parlak olan tubüllerin seçilerek eksize edilmesi, hem daha az volümde doku çıkarılmasına hem de germinal hücre bulma şansının daha fazla olmasına olanak verecektir. Mümkün olduğu kadar kanatmaksızın kesilen testis tubuli dokuları uygun kültür ortamı içine alınarak bekletilir. Testisin üst ve alt kutuplarından bilateral olarak biyopsilerin alınmasının yeterli olacağı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Ya da, her seferinde spermatozoa aranarak bulununcaya kadar işleme devam edilebilir. İşlem sonunda tunika ince absorbe olur bir sütür ile kapatılır. Hemostaz bipolar koter ile sağlanmalıdır.

Biyopsi esnasında testisin, epididimin ve vaz deferensin muyene edilmesi çok önemlidir. Bu sırada gerekirse mikrocerrahi işlemine ihtiyaç duyulabilir. İşlemin uzun sürmesi olasılığını da düşünerek genel anestezi kullanılması uygun olur.

Testislerden sperm elde etmede perkütan iğne aspirasyonu veya biyopsisi de önerilen diğer bir metoddur (47). Özellikle obstrüktif olduğuna daha önce karar verilmiş olgularda tercih edilmelidir. Sperm eldesi konusunda değişik çalışmalarda farklı sonuçlar bildirilmektedir. Ancak, eksplorasyon ile beraber testislerden açık cerrahi teknik ile TESE yapılması daha faydalı ve başarılı bir yöntemdir. Perkütan girişimlerin ancak testis biyopsisi alınmasında uygulanması doğru olur.

Sonuç olarak, azoospermi olgularında TESE ile elde edilen hücrelerin ICSI'de kullanılması, infertilite tedavisinde son derece önemli bir gelişme olmuştur. Daha erken evre germinal hücrelerin kullanılması ile fertilizasyon ve gebelik elde edilmesi gelecekte bu grup hastaların da tedavilerini mümkün kılacaktır. Ancak, yukarıda sayılan nedenlerden dolayı gerek başarının arttırılması gerekse bir komplikasyonla karşılaşmamak için, uygulamaların sadece konunun uzmanı yetkili hekimler tarafından gerçekleştirilmesi son derece önemlidir.

g) TESE ile Alınan Materyalin Hazırlanması ve ICSI'de Uygun Hücrenin Seçimi: Spermi yakından tanıyan androloji uzmanının bir diğer görevi ise TESE için çıkarılan testis dokusu içerisinde en uygun hücrenin elde edilmesinin teminidir. Testis dokusu yukarıda tanımlanan işlemlerle alındıktan sonra önce mekanik yolla parçalanır. Bu işlemin enzimatik digesyon metodu ile yapılması da tavsiye edilmektedir (48). Bizim gözlemlerimiz, mekanik ayrıştırma ile yeterli hücre elde edilemeyen olgularda enzimatik ayrıştırmanın kullanılması yönündedir. Böylece enzimlere (DNAse ve collagenase tip IV) ait muhtemel toksik etkilerden, her ne kadar spermlerin canlılığında bir bozulma yapmadıkları gösterilmişse de, korunulmuş olunur. Bu yöntemlerle eğer spermatozoa görülmüşse bunların ICSI işlemi için hazırlanmaları gerekir. Swim-up uygulanacaksa, testis dokusu ekstresi vortekslendikten sonra 5-10 dk süreyle çökmeye bırakılır. Takiben üstteki sıvı kısmı alınarak bilinen yıkama işlemine, arkasındanda swim- up'a geçilir. Sperm sayısının çok düşük olduğu olgularda direk pellet kullanılabilir. TESE olgularında değişik solüsyonlarla hazırlanmış gradient sistemleri de kullanılabilir. Bu şekilde doku artıkları, eritrositler ve lökositler büyük oranda ortamdan uzaklaştırılmış olunur. Gradient sistemleri kullanılacaksa, bunların miktarları ve santrifüj süreleri sperm sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır (49). Bu teknikte önce lökositler ortamdan uzaklaştırıldığı için, santrifüj sırasında bunlardan ortama çıkabilecek serbest oksijen radikallerinin önceden uzaklaştırılması da mümkün olmaktadır.

TESE işlemi sırasında eritrositlerin ortamdan uzaklaştırılacağı eritrosit eritici mediumları (ELB) kullanılabilir (50). Özellikle biyopsilerin aşırı kanamalı ortamda alındığı olgularda eritrosit eritici solüsyonları faydalı olabilir.

Testis dokusundan sperm elde edildikten sonra bunlar hemen ICSI işleminde kullanılabilecekleri gibi 24-72 saat süreyle kültür ortamında inkübe edilerek bekletilebilirlerde. Bu şekilde, immotil spermatozoaların maturasyonlarını tamamlayarak motil hale geçmeleri ya da yuvarlak spermatidlerin uzayan-uzamış- matür spermatid evrelerine gelmeleri mümkündür (48). Bekleme işlemi inkübatör içinde 37C'de yapılabileceği gibi 30C'de yada oda ısısında da olabilir. Oda ısısında sperm enerji tüketiminin minimal olacağı, bu nedenle daha uzun süreli saklamaların sağlanabileceği ileri sürülmektedir (51). 10 günlük saklamalarda bile motilitenin %20 oranında korunabileceği bildirilmektedir (52).Bu konuda daha geniş serilerin sonuçlarının yol göstereceği kanısındayız.

Testis dokusu alındıktan sonra bir kısmı dondurularak ileri uygulamalar için saklanabilir (53). Ayrıca, TESE yapıldıktan sonra elde edilen spermatozoalar da dondurularak saklanılabilir (39). Testis dokusu veya sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonunun her TESE olgusunda uygulanmasının gerekli olduğu kanısındayız. Bu şekilde, daha sonra yapılacak ICSI olguları için hazır hücre saklanmış olunur. İlk TESE işleminden sonra testiste damarlanmanın bozularak ya da hematom gelişimine bağlı olarak atrofi gelişmesi ve ikinci uygulamalarda hücre bulunmasını güçleştirmesi mümkündür. Testisten elde edilen spermatozoaların kriyoprezervasyonunda canlılık oranı ortalama %30 olarak bildirilmektedir. Dondurulmuş-çözünmüş epididimal spermler kullanılarak yapılan ICSI olgularında gebelik oranları bir çalışmada %33.8 olarak bildirilmiştir (39).

Yukarıda açıklanan uygulamalar sonuçta masraflı ve zahmetli bir sürecin başarısında önemli roller oynarlar. Doğru karar verilerek yapılması durumunda başarı da artacaktır. İşte androlojinin bu alanı, gerekli eğitim ve tecrübeyi içermektedir.

1-2-3-4-5-6