|
ANDROLOJİ
LABORATUVARI
Aşağıda
WHO semen ve sperm-servikal mukus etkileşimi araştırması
laboratuvar manual'i (UK, Cambridge University Press,
1999) esas alınarak, temel olarak yapılması gereken
testler verilmiştir. Araştırma ve tedavi amacıyla ilgili
başka uygulamalar da eklenilebilir.
SPERMİYOGRAM
Sperm
toplanması
Sperm
toplanmadan önce en az 48 saat, en fazla 7 günlük cinsel
perhiz süresinin olması gerekir. Sperm toplanması için
kullanılan kaplar cam ya da plastik olabilir. Toplama
kapları temiz olmalı ve sperme toksik bir madde içermemelidir.
İdeali bunun için özel amaçla yapılmış sperm toplama
kaplarının kullanılmasıdır. Mikrobiyolojik analizlerde
veya ÜYT için kullanılacaksa, steril olması tercih edilmelidir.
Kabın üzerine hasta adı ve toplama saati mutlaka kaydedilmelidir.
En az
iki sperm örneği incelenmelidir. İki sperm örneğinin
toplanması arasında klinik değerlendirime göre en az
7 gün en fazla 3 ay süre geçmesi gerekir. Sperm sonuçları
arasında anormal farklılıklar varsa örnekleme tekrar
edilmelidir.
İdeali
spermin, laboratuvara yakın bir yerde toplanarak bekletilmeden
ulaştırılmasıdır. Eğer dışarıdan getiriliyorsa 1 saat
içinde laboratuvara teslim edilmesi gerekir. Taşıma
sırasında vücut ısısında tutulmalı, 20oC'dan düşük yada
40oC'dan yüksek ısılarda bırakılmamalıdır. İlk analizde
hızlı-ileri sperm motilitesinin %25'den az olduğu olgularda
ikinci örnek toplanırken bu süre daha kısa tutulmalıdır.
Ejakulat
masturbasyonla toplanmalıdır. Bunun başarılamadığı olgularda
toksik madde içermeyen, özel olarak yapılmış kondomlar
da kullanılabilir.
Laboratuvar
personeli sperm örneklerinin virüs bulaştırabileceği
konusunda dikkatli olmaları gerekir.
Spermin
fiziksel incelemesi
Likefaksiyon:
Normal bir sperm örneği oda ısısında 60 dakika içerisinde
likefiye olmalıdır. Likefaksiyon sonunda örneğin iyice
karıştırlması yapılmalıdır. Bunu likefaksiyon süresince
aralıklı veya sürekli olarak yapılması da tercih edilir.
Likefiye olmayan spermlerin incelenmesini kolaylaştırmak
amacıyla içerisine bromelin 1g/l, plasmin 0.35-0.50
U/ml veya kimotripsin 150 USP/ml katılabilir. Ancak
bu maddelerin sperm fonksiyonları üzerine olumsuz etkide
bulunup bulunmadıkları tam olarak bilinmemektedir.
Görünüm:
Spermin muayenesi hemen likefaksiyondan sonra ya
da 1 saat içerisinde yapılmalıdır. Normalde homojen,
gri-opelasan görünümdedir. Opasifikasyonun azalması
sperm konsantrasyonunun düşük olduğunu düşündürmelidir.
Kahverengi-kırmızı örnekler eritrosit bulunduğunu akla
getirir.
Volüm:Ejakulatın
volümü dereceli, konik tabanlı silindir tüplerde yapılabilir
veya geniş bir dereceli pipete çekilerek de tayin edilebilir.
ÜYT'de kullanılacak ya da mikrobiyolojik tahlil yapılacaksa
steril malzeme kullanılmalıdır. Plastik enjektörler
ve hipodermik iğneler bu amaçla kullanılmamalıdır çünkü
sperm motilitesini olumsuz etkileyebilirler.
Viskozite:Likefiye
olduktan sonra ejakulat 5 ml'lik bir pipete çekilir
ve kendi ağırlığı ile pipetin ucundan damlaması sağlanır.
Bu sırada akarak uzayan damlanın boyu ölçülür. 2 cm'den
fazla uzaması viskozitenin artmış olduğunu gösterir.
Normalde ejakulat pipetin ucundan sarkmadan, küçük damlalar
halinde dökülmelidir. Bir diğer yöntemde ise, cam bir
çubuk ejakulatın içine daldırılır, arkasından geri çekilir.
Bu sırada oluşan cam çubuğa yapışık ejakulat uzunluğu
yüzeyden itibaren 2 cm'den fazla olmamalıdır.
Artmış
viskozite sperm motilite ve konsantrasyon sonuçları
ile antisperm antikor testlerini olumsuz etkileyebilir.
pH:Bunun
için 6.1 - 10.0 arasında pH ölçebilen indikatör kağıtlar
kullanılır. Bir damla sperm bu kagıt üzerine damlatılır.
Oluşan renk değişimi, skala ile karşılaştırılarak pH
tayin edilir. pH tayini ejakulat alındıktan sonra 1
saat içerisinde yapılmalıdır. Normali 7.2 - 8.0 arasında
olmasıdır. 7.0'ın altındaki değerler vaz agenezi veya
seminal vezikül agenezini, ejakulatör kanal obstrüksiyonlarını,
vb. düşündürmelidir.
Mikroskopik
muayene
İlk muayenede
sperm konsantrasyonu, motilitesi, aglütinasyon ve spermatozoa
dışı hücrelerin varlığı araştırılır. Taze preparatların
incelenmesinde faz-kontrast mikroskop kullanılması,
ışığın lam üzerinde saçılmasını önlemesinden dolayı,
tercih edilmelidir. 10 mikrolitre'den fazla olmayacak
şekilde bir damla semen mikropipet yardımıyla bir lam
üzerine konur. Üzerine 22mm x 22mm lamel ile kapatılır.
Bu şekilde yaklaşık 20 mikrometrelik bir derinlikte
semen araştırılmış olunur. Bu hacim içerisinde spermatozoaların
bütün rotasyon hareketleri de incelenebilmektedir. Daima
aynı değerlerin kullanılarak sperm analizinin yapılması,
sonuçların standardize edilebilmesi açısından son derece
önemlidir.
Mikroskopik
inceleme 400 - 600 x büyütmede yapılmalıdır. Hazırlanan
preparatın 37oC'da muayene edilmesi uygun olur. Eğer
20-24oC'lık oda ısısında yapılıyorsa, sonuçların bu
değere göre standardize edilmesi gerekir.
Preparat
hazırlandıktan sonra 1 dakika bekenilerek, bu süre içerisinde
stabilizasyon sağlanılır.
Sperm
yoğunluğunun her mikroskop alanında belirgin farklılık
göstermesi, ejakulatın homojen olmadığını gösterir.
Bu durumda semen tekrar karıştırılmalıdır. Ayrıca bu
durumdan, likefaksiyon bozukluğu, viskozite bozukluğu,
spermatozoa agregasyonu (mukus lifleri arasında) yada
aglütinasyon da sorumlu olabilir. Böyle bir gözlemin
sperm analiz raporunda belirtilmesi gerekir.
Sperm
sayısı düşük olan olgularda ejakulat önce 600 x g'de
15 dakika santrifüj edilerek, fazla seminal plazma atılır,
geri kalan sabit volümde semen iyice karıştırılarak
muayeneye alınır. Sonuç hesaplanırken, atılan seminal
plazma volümü de dikkate alınmalıdır. Sperm motilite
ve morfolojisi de santrifüj sonrası örnekte bakılmalıdır.
Motilite
tayini
Her bir
spermatozoanın motilitesi 4 derece üzerinden değerlendirilerek
kaydedilir:
a. ileri-hızlı
b. ileri-yavaş
c. yerinde hareketli
d. hareketsiz
4-6 mikroskop
alanı taranarak 100 spermatozoa sayılır. Her bir spermatozoa
hangi kategoriye göre hareket ediyorsa kaydedilir. Her
kategori için ortalama yüzde değerleri hesaplanır. Aynı
işlem ayrı bir semen damlası alınarak 2 kez tekrarlanmalıdır.
İki ölçüm arasında %10'dan fazla fark bulunmamalıdır.
Aksi takdirde tetkik bir kez daha tekrarlanır. Sonuçta
iki inceleme neticesinin ortalaması alınır.
Spermatozoa
dışı hücreler:
Ejakulatta
spermatozoa dışında uretradan gelen poligonal epitel
hücreleri, spermatogenetik germ hücreleri, ve lökositler
de bulunur. Bunların hepsine genel olarak "yuvarlak
hücre" denir. Taze preparatların incelenmesi sırasında
yuvarlak hücre konsantrasyonlarının da tayin edilmesi
gerekir.
Lökositler
çoğu ejakulatta görülürler. En sık nötrofillere rastlanılır.
Lökosit sayısının çok dikkatli saptanması gerekir, çünkü
lökospermi durumunda genital sisteme ait bir enfeksiyon
söz konusu olabilir ve antibiyotik tedavisi gerekir.
Lökositospermi aynı zamanda oksidatif stres ve/veya
sitotoksik sitokinleri ortama vererek ejakulat volümünde
azalma, oligoastenozoospermi, ve sperm fonksiyonlarında
bozulmalara yol açabilir.
İnfertiliteye
neden olabilecek lökosit sayısını belirlemek çok güçtür.
Bu hücrelerin önemi ejakulata nereden geldikleri, tipi
ve aktivasyon durumlarına bağlıdır. Özellikle rete testis
yada epididimden ejakulata giren nötrofil lökositlerin
neden oldukları oksidatif strese spermatozoalar daha
hassastırlar. Oysa ejakulasyon sırasında prostat veya
seminal veziküllerden ejakulata giren lökositler, seminal
plazmanın güçlü antioksidan etkisi nedeniyle daha az
zarar verircidirler. Genel olarak normal bir ejakulatın
5 milyon/ml'den fazla yuvarlak hücre ve 1 milyon/ml'den
fazlada lökosit içermemeleri gerekir.
Semendeki
lökositleri saymak için değişik teknikler kullanılmaktadır.
ELISA ile elastaz konsantrasyonunun tayini bunlardan
biridir. Hücre içi peroksidaz ve lökosite spesifik antijen
tayinleri de kullanılmaktadır.
Lökosit
sayısı ile genital enfeksiyon varlığı arasında kesin
bir ilişki kurulamamıştır. 1 milyon/ml'nin üzerinde
lökosit bulunduğu durumlarda genital glandlara ait bir
enfeksiyonun varlığı yönünden araştırma yapmak uygun
olur. Bu durumda ilk idrar, ikinci idrar, prostat masajı
ile prostat sekresyonu ve masaj sonrası idrar olmak
üzere 4 ayrı kültür gerekir. Aynı zamanda genital bezlere
ait seminal plazma markırları da tayin edilerek, enfeksiyonun
bu glandlarda bir patoloji yapıp yapmadığı araştırılmalıdır.
Bununla birlikte, semende lökosit bulunmaması genital
sisteme ait bir enfeksiyonun varlığını ekarte etmez.
Spermatid,
spermatosit ve spermatogoniumlar lökositlerden ayırd
edilmelidirler. Sadece kuyruğu gelişmiş matür germ hücreleri
olan spermatozoalar sperm sayımında geçerlidir. Lökositler
ve diğer yuvarlak hücrelerin spermatozoa sayısına göre
oranları hesaplanarak ayrıca belirtilmeleri gerekir.
Burada C = (N x S) / 100 formülü uygulanır. N aynı alanda
sayılan yuvarlak hücre tipi (örneğin lökosit yada diğer
hücreler), S mililitredeki spermatozoa sayısı, C ise
araştırılan bu hücre tipinin mililitrede milyon olarak
sayısını göstermektedir. Örneğin spermatozoa sayısı
120 milyon/ml ve her 100 spermatozoa için 10 immatür
germ hücresi sayılmışsa, (10 x 120 x milyon) / 100 =
12 milyon immatür germ hücresi / ml bulunduğu anlaşılır.
Aglütinasyon
Spermatozoanın
aglütinasyonu demek motil spermatozoaların baş-baş,
orta parça-orta parça, kuyruk-kuyruk yada benzer şekillerde
birbirlerine yapışmaları anlamına gelir. İmmotil spermlerin
birbirlerine yapışmaları ya da motil olup mukus iplikçiklerine
veya spermatozoa dışı hücrelere ve debrislere yapışmaları
nonspesifik agregasyonlar olarak kabul edilir ve mutlaka
ayrıca belirtilmeleri gerekir.
Aglütinasyonun
bulunması immünolojik nedenli bir infertilite olabileceğine
kesin olarak işaret etmez. Aglütinasyon tayini random
olarak seçilmiş 10 ayrı alanda sayılarak yapılmalıdır.
Birbirine yapışmış motil spermatozoaların yüzde olarak
hesaplanması şeklinde ifade edilir. Aglütinasyonun yaygınlığı
önemli olduğu için, az da olsalar mutlaka not edilmelidir.
Ayrıca aglütinasyonun türü de kaydedilmelidir (baş-baş,
vb).
Mikroskopik
inceleme sırasında yapılacak diğer araştırmalar
Sperm
vitalitesi tayini (eozin boyaması, HOS testi
- hipoozmalar şişme testi)
Eozin-Y
Vitalite Testi
İmmotil
spermatozoa sayısının %50'den fazla olması durumunda
canlı spermatozoa sayısını saptamak amacıyla özel boyama
teknikleri uygulanır. Bu testin temeli, ölü spermatozoaların
membran yapısı da bozulacağından, boyaları içlerine
almasına dayanmaktadır.
Işık mikroskopu
veya fazkontrast mikroskop altında 100 hücre sayılarak,
canlı (boya almamış) ve ölü (boyanmış) spermatozoalar
kaydedilir. Bu şekilde immotil olan spermatozoaların
canlı ya da ölü olup olmadıkları anlaşılabilir. Test
aynı zamanda spermiyogramın motilite değerlendirmesini
kontrol da etmiş olur, çünkü ölü hücre sayısı immotil
hücre sayısını aşmamalıdır. Hareketsiz olup boya almayan,
yani canlı olan spermatozoalarda kuyruk defekti bulunduğu
düşünülür ve bu hastalar ICSI için uygun adaylardır.
Teknik
Önce Eosin-Y
solüsyonu hazırlanır. Bunun için Eosin-Y'nin % 0.9 (9
g/l) sodyum klorid solüsyonu içerisinde %0.5 (5 g/l)
'lik solüsyonu hazırlanır. Yada, bu amaçla hazırlanmış
hazır solüsyonlar da temin edilerek kullanılabilir.
Bir mikroskop
lamı üzerine 1 damla (10-15 mikrolitre) taze semen ve
1 damla %0.5 Eosin solüsyonu konularak karıştırılır
ve lamel ile kapatılır.
Bir veya
iki dakika sonra 400X büyütmede, ışık mikroskopu yada
fazkontrast mikroskop altında incelenir. Boya almamış
(canlı) ve boyanmış (ölü) hücreler sayılır.
Eosin-Nigrosin
Boyası ile Vitalite Testi
Distile
su içerisinde %1 (10 g/l) Eosin-Y solüsyonu ve distile
su içerisinde %10 (100 g/l) Nigrosin solüsyonları hazırlanır.
Bir damla
semen 2 damla %1 Eosin-Y ile bir tüp içerisinde karıştırılır.
30 saniye
sonra 3 damla %10 Nigrosin eklenir, ve karıştırılır.
Karışımdan
1 damla alınarak lam üzerinde yayma yapılır. Havada
kurumaya bırakılır. Daha sonra mikroskop altında incelenir.
Bu yöntem
ile hazırlanan preparatların saklanılarak daha sonra
tekrar bakılarak incelenme olanağı vardır.
HOS
Testi (Hipoozmolar ortamda şişme test)
Basit
bir test olup, sağlam hücre membranının semi-permeabilitesi
nedeniyle hipoozmolar bir ortama konulduğu zaman spermatozoa'nın
içine su alarak şişmesi esasına dayanmaktadır. Spermatozoanın
fonksiyonuna yönelik bir test olarak kullanılmayıp,
ek bir inceleme yöntemi olarak kabul edilmelidir. Yapımı
ve skorlaması kolay olup, sperm kuyruğunun hücre membranının
bütünlüğü ve kompliansı hakkında bilgi verir. Normalde
%50'nin üzerinde spermatozoanın pozitif sonuç vermesi
gerekir.
Tekniği
HOS solüsyonunu
hazırlamak için 100 ml distile su içerisinde 0.735 g
sodyum sitrat (Na3C6H5O7.2H2O) ve 1.351 g früktoz karıştırılır.
Parçalara ayrılarak, -20oC'da saklanılır. Kullanılacağı
zaman eritilir ve iyice karıştırılır.
Test yapılırken,
1 ml HOS solüsyonu ağzı kapaklı Eppendorf tüpü içerisinde
37oC'da 5 dk ısıtılır. 0.1 ml likefiye olmuş semen eklenir.
En az 30 dk süreyle (120 dk'yı geçmeyecek şekilde) 37oC'da
bekletilir. Daha sonra bir damla alınarak lam üzerine
konulur ve fazkontrast mikroskopu altında incelenir.
Kuyruğun şekline bakılarak, şişme durumu değerlendirilir.
100 spermatozoa sayılır.
Şekilde
HOS testi sonucu değişik şekiller almış kuyruk örnekleri
görülmekte. (a) normal, (b-g) değişik şekiller. Şişme
gösteren kuyruk kısımları içleri çizilerek belirtilmiştir.
Sperm
konsantrasyonu tayini
Spermatozoa
sayımını 2 metodla yapmak mümkündür: Neubauer hemositometresi
ve Makler kamarası. Neaubauer kan sayma lamı üzerine
sperm sulandırıldıktan sonra konularak sayım yapılır.
Makler'de ise sulandırmaya gerek yoktur. Neaubauer için
likefiye olan sperm örneği bir lökosit pipetine 0.5
işaretine kadar çekilir. Üzerine 11 işaretine kadar
%5 NaHCO3 + %1 formalin karışımı eklenir ve iyice karıştırılır.
Bu şekilde 1/20 oranında bir dilüsyon olur. Anlatıldığı
şekilde yapılması durumunda 50 mikrolitre semen 950
mikrolitre dilüsyon solüsyonu ile karıştırılmış olmaktadır.
Dilüsyon solüsyonunun hazırlanması için ise 50 g sodyumbikarbonat
(NaHCO3) 10 ml'lik %35 formalin ile (v/v) karıştırılarak,
son volüm 1000 ml'ye tamamlanır. Kullanılan karışım
spermleri immobilize edeceği için de sayımı kolay olmaktadır.
Sulandırma
işlemini takiben ilk birkaç damla dışarı atılır ve arkasından
Neaubauer lamının iki kanalı içine birer damla (10-20
mikrolitre) bırakılır, üzeri lamel ile kapatılır. 2
dakika stabilizasyonu için beklenildikten sonra sayıma
geçilir. Her biri 16 küçük kare içeren 5 büyük kare
içindeki hücreler sayılır. Sulandırma oranına göre mililitredeki
hücre sayısı hesaplanır. 1/20 dilüsyon için 5 büyük
kare içindeki hücre sayısı bir milyon ile çarpılır.
1/10 sulandırmada önce ikiye bölünüp sonra bir milyon
ile çarpılır. Eğer tüm büyük kareler sayıldıysa bulunan
toplam hücre sayısı 1/20 dilüsyon kullanıldıysa, sadece
200 000 ile çarpılacaktır. İki sayım arasında &20'den
fazla fark varsa sayım tekrarlanmalıdır. Sperm konsantrasyonu
20 milyon/ml'den az olan olgularda daha az sulandırma
yapılmalıdır.
Makler
metodunda ise bu amaç için özel olarak dizayn edilmiş
bir sayım kamarası kullanılır. Bu kamaranın lam ve lameli
arasında 10 mikron3'lük sabit bir hacim bulunmaktadır
(10 mikrometre derinlikte). Yüzeyinde ise 0.1mm X 0.1mm
boyutlarında 100 kareden oluşan bir ağ içerir. Ejakulat
likefiye olduktan sonra ve diğer mikroskopik incelemeleri
yapıldıktan sonra 50oC'da 3 dk ısıtılarak spermatozoaların
immobilize olmaları sağlanılır. 1 damla sperm Makler
kamarasının ortasına yerleştirilir ve üzeri lameli ile
kapatılır. X20 büyütmede incelenir. 10 küçük kare içerisindeki
hücre sayısı sayılarak 1 milyon ile çarpılır. Bu sayı
1 mililitredeki hücre sayısını verir.
Sperm
morfoloji analizi
Antisperm
antikor tayini (IBD, MAR testleri)
Spermatozoaların
yüzeyini kaplayan antisperm-antikorların varlığı immünolojik
infertilite için spesifik olarak kabul edilir. Semen
içindeki sperm antikorlaraı genelde iki çeşittir: IgA
ve IgG. IgA'nın klinik önemi IgG'den daha fazladır.
IgM, molekül büyüklüğü nedeniyle semende görülmez.
Antikorların
saptanması taze ejakulatta IBT ve MAR testleri ile yapılır.
Bu testlerin
yapılabilmesi için sperm sayımında ileri hareketli en
az 100 spermatozoanın bulunması gerekir. Ejakulatta
fazla mukus bulunması test sonuçlarını olumsuz etkileyebilir.
IBT ve MAR testi sonuçları her zaman korale olmayabilir.
IBT, sperm aglütinasyon ve immobilizasyon testleri ile
daha uyumlu sonuçlar vermektedir. Bu testlerin pozitif
bulunması halinde sperm-servikal mukus kontakt testi
yada sperm-servikal mukus kapiller tüp testleri ile
serumda antikor titrasyonu testleri de tanıyı teyid
etmek için yapılabilir.
Immunobead
Test (IBT)
IBT testi
ile sperm yüzeyine yapışık antikorlar saptanabilirler.
Immunobead partikülleri tavşan anti-immünglobülünlerine
bağlı polyacrylamide taneciklerdir. Testin yapılışı
için, öncelikle ejakulat sperm yıkama mediumu ile karıştırılarak
santrifüj edilerek birkaç kez yıkanır. Daha sonra sperm
süspansiyonu immünobead süspansiyonu ile karıştırılır.
400 x büyütmede faz kontrast mikroskop altında incelenir.
Spermatozoa süspansiyon içinde yüzdükçe immunobead +
anti-immünglobulin partikülleri yüzeyinde antikor bulunan
spermlere yapışırlar. Yüzeyine immunobead bağlı sperm
oranı hesaplanır. Ayrı ayrı immunglobülinler kullanılarak,
IgG, A ve M için test tekrarlanır. Ancak, her üç grup
antikoru total olarak saptamak amacıyla ( total B-hücre
bağlanması) one-step test de geliştirilmiştir.
%20 veya
daha fazla motil spermatozoanın parçacıklara bağlanmış
olması durumunda test pozitif kabul edilir. Ancak, servikal
mukus içinde sperm penetrasyonu ve in vitro fertilizasyon
%50 veya daha fazla motil spermatozoanın antikor bağlı
olması durumunda anlamlı derecede bozulmaktadır. Bu
nedenle, immunobead testinin anlamlı olarak bozuk kabul
edilmesi için en az %50 spermatozoanın antikor tutulumu
göstermesi gerekir. Sperm kuyruğuna bağlı antikorların
fertilizasyon üzerine olumsuz etkileri bulunmamaktadır.
Mixed
antiglobulin reaction test (MAR test)
Taze spermin
immünglobülin bağlanmış latex partikülleri yada koyun
eritrositleri ile karıştırılmasıyla yapılır. Bu karışıma
ayrıca monospesifik anti immünglobülin (IgG veya IgA)
eklenir. Partiküller ile motil spermatozoaların aglütinasyon
oluşturması durumunda test pozitif kabul edilir. %50
veya daha fazla motil spermatozoanın partiküllere bağlanmış
olması, immünolojik infertilite tanısı koydurur. %10
ile %50 arasındaki bağlanmalar şüpheli immünolojik etyoloji
olarak kabul edilir.
Opsiyonal
testler
Semen
kültürü
Kültür
için ejakulat toplanmasında kontaminasyonu önlemek için
özen gösterilmelidir. Sperm çıkarılmadan önce idrar
yapılmalı. Hemen arkasından el ve penis sabun ile yıkanıp,
iyice durulanıp kurulanmalıdır. Sperm steril bir kap
içine toplanarak mikrobiyoloji laboratuvarına teslim
edilir. Genital bezlere ait enfeksiyon varlığını ortaya
koymak için hem aerobik hem de anaerobik kültürler yapılmalıdır.
Aerobik
bakteri kültürleri kanlı agar içinde yapılır. Eğer bakteri
konsantrasyonu 1000 koloni /ml'yi geçerse, koloni tipi
tayin edilir. Koloni uniform görünümdeyse, tiplendirme
ve antibiyogram yapılabilir. Ama koloni görünümü heterojenik
ise kontaminasyon bulunabileceği düşünülerek yeniden
semen toplanmalı ve test tekrarlanmalıdır.
Eğer bakteri
konsantrasyonu 1000 koloni/ml'den az ise aerobik bakteri
varlığı bakımından test negatif kabul edilebilir. Genital
enfeksiyon araştırması için ayrı özel mikrobiyoloji
laboratuvarının bulunması gerekir.
Biyokimyasal
testler
Aşağıdaki
spesifik markır miktarlarının düşük bulunması, o glandın
fonksiyonunda bir bozukluğa işaret eder. Özellikle enfeksiyonun
varlığı sekresyon fonksiyonlarında azalmaya yol açabilir.
Eğer enfeksiyon tedavisinden sonra bir düzelme olmuyorsa
kalıcı bozukluk yerleşmiş demektir. Enfeksiyonun bulunması
mutlaka markırlarda bir bozulma yapacaktır anlamına
gelmez.
Prostat
için çinko ve sitrik asit
Seminal
veziküller için früktoz, düşük pH, volüm azlığı, koagülasyon
olmaması, koku tetkiki
Epididm
için L-karnitin, nötral (daha spesifiktir) ve asidik
alfa-glükozidaz, gliserofosfokolin
İmmatür
germ hücrelerinin analizi
Ejakulatta
immatür germ hücrelerinin bulunması spermatogenez bozukluğunu
gösterir. Ayrıca, germ hücrelerinin mayotik kromozomları
çalışılarak kromozomal bozukluklar tanınabilir.
Araştırma
amaçlı testler
Spermatozoa
fonksiyonları için serbest oksijen radikalleri, kreatin
fosfokinaz bakılabilir. Bunların artmış olması patolojiktir.
Özellikle spermatozoa orta parça defektlerindeki anormalliklerle
birlikte görülür.
Zonası
çıkarılmış hamster oosit testi
İnsan
zona pellusida bağlanma testi
Akrozom
reaksiyonu skorlaması
Kompüterize
sperm analizi
Özellikle
sperm motilitesinin satndardize edilmiş doğru ve detaylı
analizi için kullanılır. Spermatozoaya ait zamana bağlı
kinetik parametrelerinin hesaplanması esasına dayanır.
Mikroskop ile irtibatlandırılmış bir videokamera kullanılır.
Kompüterize analiz teknolojisi henüz tüm dünyaca kabul
edilmiş rutin bir uygulama haline gelmemiştir. Bununla
birlikte, sperm hareketlerinin değerlendirilmesinde
göz ile değerlendirmeye göre daha kesin değerler verir.
Sıklıkla
sperm hareket özellikleri içn kullanılırsa da, sperm
konsantrasyonu ve morfoloji değerlendirmesinde de faydalanılabilir.
SPERM
HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ
Amaç
- Prostaglandin ve diğer
inhibitör maddelerin spermden uzaklaştırılması
- İleri-motil spermatozoaların
konsantre edilerek toplanması
- Spermatozoaların motilite
ve ileri hareketlerini artırmak
- Seminal plazma volümünü,
uterusa verilebilecek miktara kadar azaltmak
Sıklıkla
kullanılan yöntemler
- Swim-up (yüzdürme)
tekniği
- Standart yıkama yöntemi
(santrifüj ve yüzdürme)
- Gradient tekniği
- Mini-gradient yöntemi
Swim-up
(yüzdürme) yöntemi: Tüm ejakulat 0.5-1 ml'lik fraksiyonlar
halinda ayrı ayrı konik tüplere konulur (Falcon tüpler,
15 ml'lik). Üzerlerine 2 ml sperm yıkama mediumu eklenir.
Tüpler 37oC'da 1-2 saat süreyle %5 karbondioksitli ortamda
45o eğimli pozisyonda inkübe edilir. İnkübasyon sonunda
üstteki 1ml'lik kısım pipetle alınarak kullanılır. Bu
yöntemin sakıncası, ileri derecede oligozoospermi ya
da astenozoospermi olgularında yeteri kadar sperm elde
edilememesidir.
Standart
yıkama yöntemi (santrifüj ve yüzdürme): Likefiye
olmuş semen konik bir tüp içerisinde 1 : 1-2 volüm oranında
sperm yıkama mediumu ile karıştırılır. 200-300 x g'de,
10-15 dakika santrifüj edilir. Üstteki supernatant kısmı
atılarak, dipte kalan pellet 0.5 ml medium ile tekrar
karıştırılarak kullanılabilir. Bu işlem 2 kez tekrarlanabilir
ya da ileri derecede oligozoospermi olgularında sadece
1 kez yapılarak bırakılır. İstenilen olgularda, alttaki
pellet kısmının üzerine 1-2 ml medium konularak, 37oC'da
1-2 saat süreyle %5 CO2 ortamında inkübe edilir ve daha
sonra üstteki 1 ml kısım pipet yardımıyla alınarak kullanılır.
Bu şekilde daha fazla sayıda motilitesi iyi sperm elde
edilmiş olunur.
Gradient
tekniği: Burada silica partiküller içeren gradient
mediumlar kullanılır. 15 ml'lik konik Falcon tüpü içerisine,
aşağıdan yukarıya doğru her birinden 1 ml olacak şekilde
%90, %70 ve %50'lik gradient solüsyonları üst üste konularak
3 tabakalı yıkama yapılabilir veya sadece 2-3 ml %80
ve 2-3 ml %40'lık iki tabaka ile hazırlanmış yıkama
da kullanılabilir. En üstteki tabakanın üzerine, her
bir gradient tabakası için 1 ml olacak şekilde, 2-3
ml likefiye olmuş ejakulat sarsmadan bırakılır. 200-500
x g'de 10-20 dakika santrifüj edilir. Daha sonra, en
alttaki fraksiyon (kullanılan gradient miktarına göre
1 yada 2-3 ml) geride bırakılarak üstteki supernatant
kısmı bir pipetle aspire edilerek dışarı atılır. Dipte
bırakılan kısım, 1 : 1 volüm medium ile karıştırılarak
yukarıda tarif edildiği şekilde yıkanır (100 x g'de
10 dakika veya 500 x g'de 5 dakika olacak şekilde) ve
altta toplanan pellet üzerine 0.5 ml medyum eklenilerek
kullanılır.
Mini-gradient
yöntemi: İleri derecede oligozoospermi olgularında
bu yöntem modifiye edilerek uygulanmalıdır. Her bir
gradient tabakasından 0.3 ml konulur. Burada kullanılacak
sperm, önce 100 x g'de 10 dakika yıkanmalı ve bu şekilde
volümü azaltılmalı, daha sonra gradient solüsyonlarının
üzerine konulmalıdır. İşlemin diğer basamakları aynen
uygulanır.
Gradient
yöntemlerinde, spermler partiküllerin arasından aşağıya
doğru yüzerek dipte toplanırlar. Ayrıca bu yöntemde,
akrozom membranı üzerine olan mekanik etkinin de fertilizasyonu
arttırıcı etkisi bulunduğu ileri sürülmektedir. İmmatür
hücrelerin ve lökositlerin de ortamdan uzaklaştırılmaları,
bunlardan açığa çıkabilecek serbest oksijen radikallerini
azaltarak, fertilizasyonu düzeltiyor da olabilir. Bir
diğer önemli husus ise santrifüj hızıdır. 200 x g'den
fazla hızlar kullanılırsa, immotil spermler ve debrisler
de dibe çökebileceklerinden, kaliteli sperm elde edilmesini
önleyebileceği bildirilmişse de, 2 tabakalı gradient
yönteminde 500 x g'nin kullanımı da önerilmektedir.
Gradient
yönteminde gradient solüsyonları üzerine sperm konulduktan
sonra uygulanacak santrifüjün süresi çok önemlidir.
Öncelikle motil olan spermler dipte toplanacağından,
sürenin uzaması halinde nonmotil hücreler ve debrisler
de dipte birikeceklerdir. Genel olarak, normal sperm
parametrelerinde 10-20 dakika, orta derecede bozulmuş
olanlarda 10-30 dakika, ileri derecede bozuk sperm örneklerinde
ise 15-45 dakika santrifüj edilmeleri önerilir. Viskozitesi
artmış spermler, motilitesi %20'den az olan spermler
ve hücre sayısı 20 milyon/ml'den fazla olan spermlerin
de uzun süreli santrifüj edilmeleri gerekir. Normal
morfoloji oranları düşük spermlerin ise daha kısa süreli
santrifüj edilmeleri uygun olur.
|
