Dr.Kaan AYDOS

İNTRASELLÜLER SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ (reaktif oksijen türevleri) ÜRETİMİNİN İNSAN SPERMATOZOASININ YAPISAL VE FONKSİYONEL BÜTÜNLÜĞÜNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ: LİPİD PEROKSİDASYONU, DNA FRAGMANTASYONU VE ANTİOKSİDANLARIN ETKİLERİ

SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLARIN SPERMATOZOA ÜZERİNE ETKİLERİ VE KLİNİK ÖNEMİ

ERKEK SUBFERTİLİTESİNDE OLASI BİR UYGULAMA: ANTİOKSİDAN TEDAVİ

ANTİOKSİDAN TEDAVİ, İNFERTİLİTE TEDAVİSİNDE ÜMİT VERİCİ BİR YÖNTEM

GLUTATYON TEDAVİSİ

İNTRASELÜLER SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ (REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ) ÜRETİMİNİN İNSAN SPERMATOZOASININ YAPISAL VE FONKSİYONEL BÜTÜNLÜĞÜNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ: LİPİD PEROKSİDASYONU, DNA FRAGMANTASYONU VE ANTİOKSİDANLARIN ETKİLERİ

İnsan spermatozoasının nikotinamid adenin dinükleotid fosfata (NADPH) maruz kalması doz bağımlı olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretilmesiyle sonuçlanır. Kritik bir yoğunluk seviyesinde lipid peroksidasyonu indüklenir, DNA hasarı ve sperm motilitesinde dramatik bir düşüş meydana gelir. Bu sistem daha sonra değişik antioksidanların, metabolizmanın intraselüler artmış toksik oksijen ürünlerini tarafından oluuşturulan oksidatif stresle mücadele yeteneklerini ortaya koymak için kullanılmıştır. Bu sistemde ekstrasellüler kaynaklı oksidanlara karşı koruyucu olan değişik antioksidanların (superoksit dismutaz, katalaz, vit. E, hipotaurin) bir etkinliğinin olmadığı ortaya konmuştur. Halbuki albumin NADPH'nın indüklediği oksidatif strese karşı tam bir koruma sağlar. Bunu lipid peroksidasyon kaskadını supresyondan daha çok oluşum sürecindeki peroksitleri inaktive ederek sağlar. Albumin NADPH tarafından indüklenen DNA hasarında koruyucu değildir fakat glutatyon peroksidazın merkaptosüksinatla inaktive edilmesinden dolayı meydana gelen DNA fragmentasyonuna karşı korumada son derece etkilidir. Bu çalışma şunu vurgulamaktadır klinik olarak etkili antioksidan tedavilerin düzenlenmesi kritik olarak oksidatif stresin nerden kaynaklandığına bağlı olacaktır. Fazla miktarda intraselüler ROS üretimini de kapsayan vakalarda albumin lipid peroksit bağımlı sperm plasma membran ve DNA hasarlarında, albumin bunu nötralize edecek önemli bir vasıta gibi durmaktadır.

Oksidatif stresin defektif sperm fonksiyonu etyolojisinde, plasma membranına peroksidatif hasar indüksiyonu mekanizmasıyla, önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Ek olarak oksidatif stresin sperm genomu bütünlüğü üzerine etkilerinin yüksek frekanslarda tek ve çift sarmallı DNA zincir kırığı olduğu da tesbit edilmiştir. Oksidatif hasarın insan spermatozoasına etkisinin klinik önemi yıkanmış insan sperm suspansiyonlarında, spermlerin dölleme kapasitesi ve ROS üretimiyle ilişkisi gözlenerek ortaya konmuştur.

Antioksidanların erkek infertilitesinin in-vivo ve in-vitro tedavilerinde kullanımı, insan sperm fonksiyonuna zararlı etkileri belirlenen ROS'u muhtemel bir yolla etkisiz hale getirdikleri düşünülerek, beklenilmektedir.

Yakında yapılan in vivo plasebo kontrollü bir çalışma, peroksidatif hasara karşı oral E vitamini tedevisinin potansiyel bir değerinin olduğunu göstermiştir.

İn vitro olarak değişik antioksidanların insan spermatozoasını oksidatif hasara karşı koruma yetenekleri değişik modellerde gösterilmiştir. Örneğin ksantin oksidaz insan spermatozoasının motilitesini önemli derecede azaltan reaktif oksijen metabolitlerinin üretilmesinde kullanılmıştır. Bu modelde superoksit dismutaz yerine katalaz eklenmesiyle sperm hareketinin önemli ölçüde daha çok yerine geldiği gözlenmiştir.

Bu şartlar altında hidrojen peroksitten ziyade süperoksitin insan spermatozoasına zarar verdiği düşünülmektedir. Bu sonuçta gözönüne alınarak insan spermatozoasının hidrojen peroksite maruz kalması sonucu fonksiyon kaybı ve yüksek oranda DNA hasarı geliştiği ileri sürülmektedir.

İnsan spermatozoasında oksidatif stres yaratmanın bir ikinci yolu ise bu hücrelerin aktive edilmiş nötrofillerle ko-inkubasyonudur. Bu modelde belli bazı antioksidanlar (Hipotaurin ve N-asetilsistein) tarafından engellenen ama başka antioksidanlar (E vit.) tarafından engellenemeyen önemli ölçüde sperm motilite kaybı gözlenmiştir.

Yukarıda belirtilen yaklaşımların hepsinin esas problemi spermatozoaya saldıran ROS'un hücre dışından kaynaklanmasıdır. Bu durum fizyolojik olarak; toksik oksijen metabolitlerini eğer infiltran nötrofillerden salınıyorsa, antioksidanların bu metabolitlerin toksik etkilerini engelleme yeteneklerini göstermesi açısından anlamlıdır. Halbuki oksijen radikalleri sıklıkla intrasellüler kaynaklıdır; yüksek miktarlarda ROS üreten oligozoospermik erkeklerde olduğu gibi.

Alternatif antioksidan stratejiler geliştirmek ve en iyi şekilde spermatozoayı artmış intraselüler ROS üretiminden korumak için spermatozoaların kendikendilerine hızlanmış toksik oksijen metabolitleri üretimini de kapsayan değişik bir model sistem gereklidir.

Yakın tarihte bir araştırmada insan spermatozoasında ROS üretiminin NADPH'ya bağımli olduğu gösterilmiş ve bu ajana artifisiyal maruziyetle ROS artışı, böyle bir model için temel alınmıştır.

Aşağıdaki çalışmada bir NADPH'nın ROS üretimini indükleyerek insan spermatozoasındaki fonksiyonel ve genetik bütünlüğüne olan etkisi ve bu sistemi artmış intraselüler toksik oksijen metabolitlerine karşı değişik antioksidan stratejiler geliştirmek üzere inceleniştir.

Sonuçlar

NADPH DOZ YANIT ANALİZİ

NADPH'nın ROS üretimini indüklemesi ve peroksidatif hasara neden olması ve sperm motilitesini azaltması, doz bağımli analize tabii tutulmuştur. Dozlar 1, 5 ve 10 mikroMol NADPH ve kontrol olarak aynı dozlarda NADP olarak ayarlanmıştır. İnkubasyonlar 24 saat süreyle 1 mg/ml PVA'lı BWW ortamında tutulmuşlardır.

1, 5 ve 10 mikroMol NADPH ile spermatozoa tarafından ROS üretilmesinde önemli ölçüde bir artış saptanmamıştır. Karşıt olarak her üç doz NADPH ile ROS üretimi önemli derecede artmıştır. Test edilen 2 yüksek dozda ROS üretimi lipid peroksidasyonunu indüklemiş ve sperm hareketinde önemli bir düşüşe neden olmuştur.

SOD VE KATALAZIN ETKİLERİ

İnsan sperm fonksiyonunun korunmasında SOD ve Katalazın yararlı etkileri daha önceki çalışmalarda gözlendiğinden bu antioksidanları endojen ROS nin indüklediği peroksidatif hasara karşı etkinliği araştırılmıştır. Katalaz ( 200, 500 ve 2000 Ü) ve SOD ( 100, 250 ve 500 Ü) 24 saat 5 mikroMol NADPH lı ve NADPH'sız sperm suspansiyonlarına eklenmiştir. NADPH bu çalışmada da önemli derecede sperm motilitesini azaltmış ve önemli ölçüde spermde peroksidatif hasara neden olmuştur. Buna rağmen SOD ve katalaz hiç bir dozda tek başlarına veya beraber sperm motilitesini arttıramamışlar ve peroksidatif hasara engel olamamışlardır.

SERBEST RADİKAL TEMİZLEYİCİLERİ

Bir kaç çeşit serbest radikal temizleyici NADPH'nın indüklediği ROS üretimine bağlı peroksidatif hasarı ve beraberinde sperm hareket kaybını suprese eder mi diye çalışılmıştır. Aşağıdaki antioksidanların hiçbirinin efektif olmadığı saptandı; Vit. E 1 mM, hidroksitoluen( 0.01, 0.1 ve 10 mM), pentoksifilin (3.6 mM), ve taurin. Ek olarak bir demir şelatörü olan dietilen triamin penta asetik asit (DETEPAC) da insan spermatozoasını NADPH'nın indüklediği oksidatif hasardan koruyamamıştır ama DETEPAC kontrol inkubasyonlarında önemli ölçüde motiliteyi korumuştur. Mekanizma olarak in-vitro uzamış inkubasyonlarda demirin indüklediği lipid peroksidasyonunu ve sperm motilite kaybı artışını engellemesi öne sürülmüştür.

ALBUMİN

Albuminin insan spermatozoasını, endojen oksidatif stresden korumasındaki önemi bir seri ek deneysel çalışmalarda araştirılmıştır. Bu deneylerde NADPH'a maruz kalan spermatozoaların 24 saat 37 C'de PVA (1 mg/ml) veya albumin ( %0.3, %3 ve % 10) varlığında motilite ve lipid peroksidasyon potansiyeli değerlendirilmiştir.

PVA varlığında daha önceki deneylerde olduğu gibi NADPH tarafından indüklenen peroksidatif hasar sperm motilitesinde önemli bir düşüşe neden olmuştur.

NADPH yokluğunda inkubaşyon ortamında albuminin bulunması sperm motilitesinde PVA kontrollerine göre önemli bir değişiklik göstermemiştir. Halbuki NADPH varlığında albumin eklenmesinin sperm motilitesinin korunmasında, %0.3den %10'a kadar artan albumin konsantrasyonlarına paralel olarak artan önemli bir etkisi olmuştur. İnsan spermatozoasının ROS üretim yeteneğini engelleyecek derecede yüksek konsantrasyonlarda BSA bulunmamasına rağmen albuminin lipid peroksidasyon düzeylerine olan etkisi çalışılmıştır. Şaşırtıcı olarak, albumin varlığında spermatozoa tarafından üretilen malondialdehit düzeyleri ortamda PVA bulunmasıyla oluşan malondialdehit düzeyleriyle aynı bulunmuştur. Buradan şunu çıkarabiliriz NADPH sitümülasyonuna bağlı ROS üretiminde albumin lipid peroksidasyonunu suprese etmemekte hatta lipid peroksitleri spermatozoadan uzaklaştırmamaktadır. Bunun yanısıra albuminin, lipid peroksidasyon şelalesinde plasma membranında oluşan toksik lipid peroksitleri bağlayarak oksidatif stresin etkilerini nötralize ettiği düşünülmektedir.

Deneyin ilk safhasında gösterilmiştir ki, demir ve askorbatla başlatılan lipid peroksidasyonunda, lipid peroksidasyon şelalesinde üretilen peroksitlerin büyük bir çoğunluğu çevre ortama salınmış ve spermatozoalar tarafından tutulmamışlardır. 5 mM NADPH varlığında 24 saatlik inkubasyonda tutulan spermatozoalar 5 dk 500 devirde santrifüje edilmişler ve tekrar bir ferröz demir promoter li bir ortamda 2 saat daha inkubasyona tabii tutulmuşlardır ( 0.04 mM FeSO4 ve 0.2 mM askorbik asit, Ca ve Mg bulunmayan Hanks ortamında).

Promoter bulunmayan örnekler ise sadece Ca ve Mg bulunmayan Hanks ortamında tutulmuşlardır.

Promosyon peryodundan sonra bütün sperm suspansiyonundaki ve sadece spermatozoalarda ve sadece inkübasyon ortamında bulunan malondialdehid düzeyi ölçülmüştür. Bu ölçüm ortaya koymuştur ki, promoter varlığında oluşan malondialdehid'in % 70'i hücrelerden çevre ortama salınmaktadır.

Düşünceler

Oksidatif stres, in-vivo ve in-vitro antioksidan tedavi ile önlenebilinecek, defektif sperm fonksiyonunun önemli bir sebebidir. İn-vivo, plasebo kontrollü, kendi spermlerine yüksek derecede peroksidatif hasar gösteren hastalar üzerinde yakınlarda yapılan bir çalışmada, oral E vitamini tedavisinin terapötik bir değerinin olabileceği öne sürülmüştür ( Suleiman et al. 1996). İn-vitro, oksidatif stresin aktive lökositlerle gerçekleştirildiği çalışmalar dahil olmak üzere, hipotaurin, indirgenmiş glutatyon ve N-asetil sisteinin de dahil olduğu çok geniş bir aralıkta antioksidanların insan spermatozoasını ekzojen kaynaklı toksik oksijen metabolitlerinden korumada potansiyel klinik değerleri olduğu gösterilmiştir (Baker et al 1996). Ne yazık ki bugüne kadar antioksidanların insan spermatozoasını endojen kaynaklı ROS'dan koruma kabiliyetlerini gösterecek bir model geliştirilmemiştir (Gomez et al. 1996).

İnsan spermatozoasının ROS üretim biyokimyası henüz tam detaylarıyla çözülmemiş olmasına karşın bu hücrelerde NADPH'nın süperoksit üretiminde bir subsrat olarak davrandığı gözlenmiştir ( Aitken et al 1997, Griveau ve Le Lannou 1997). Bu çalışmada, ekzojen NADPH'nın doz bağımlı olarak insan spermatozoasında ROS üretimini indüklediği ve test edilen en yüksek dozda önemli bir peroksidatif hasara ve sperm motilitesinde dramatik bir kayba yol açtığı kaydediliştir. Spermatozoaları ekzojen kaynaklı ROS'dan koruyan SOD, katalaz, hipotaurin, DETEPAC, pentoksifilin veya vitamin E gibi ajanların hiçbirinin NADPH'nın indüklediği oksidatif strese karşı etkin olmadığı gösterilmiş olup bunun nedeni ROS'in intraselüler orjinli olması olarak düşünülmüştir.

Yukarıdaki çalışmada spermatozoayı NADPH'nın indüklediği hasardan koruyan tek madde albumindi. %0.3'den %10'a varan konsantrasyonlarda albumin insan spermatozoasının hareketliliğini NADPH tarafından stimüle edilen yüksek miktarda ROS üretimine rağmen koruyabildi. Daha da fazla olarak albuminin lipid peroksidasyonunu inhibe etmeyerek koruma görevini yerine getirdiği gözlenildi çünkü albumin varlığında veya PVA varlığında ölçülen NADPH'nın indüklediği malondialdehid miktarları benzer olarak ölçüldü.

Burdan şu sonucu çıkarabiliriz; ek bir maddenin varlığında dahi NADPH'ya maruz kalmak peroksidatif hasarı indükler ve plasma membranında lipidhidroperoksitlerin birikimine sebep olur. PVA varlığında bu lipid peroksitler sitotoksik etkilerini sperm motilitesinde önemli bir düşüşle gösterirler. Halbuki albumin varlığında bu lipid peroksitler bir şekilde sekestre olurlar ve sperm fonksiyonu etkilenmez. Albuminin sitotoksik lipid peroksitleri nötralize etme yeteneğinin deneysel doğrulaması bir ferröz iyonlu promoter kullanılan çalışmalarla kanıtlanmıştır.Spermatozoaya promoter eklendiğinde ortama önemli miktarlarda lipid peroksit yayılmasına neden olan hızlı bir lipid peroksidasyon kaskatının indüklendiği görülmüştür. Bu peroksit salınımı tahminen fosfolipaz A2 aktivitesi sonucudur. Bu enzimin insan spermatozoasında koruyucu bir role sahip olduğu bilinmektedir. Fosfolipaz A2 okside yağ asitlerini, alkollere benzer bir biçimde, fosfolipid gliserol zincirinin 2. pozisyonundan bağlar ve bunları glutatyon peroksidaz tarafından metabolize edilebilir hale getirir. Bu kadar yüksek miktarda lipid peroksitin kültür ortamında bulunması kuşkusuz fosfolipaz A2 tarafından plazma membranından salınan herhangi bir doymamış yağ asidinin sekonder peroksidasyonunu indükleyen bir promoter sisteminin varlığını ortaya koyar. Taze hazırlanmış spermatozoa kültürlerinde ferröz iyonlu promoter varlığında oluşun peroksitleri de kapsayan, peroksitlerin biyolojik sistemlerde sitotoksik olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular lipid peroksitlerin insan spermazoasına sitotoksik olduğunu gösteren kanıtları artırmaktadır. Önemli olarak, bu lipid peroksitlerin sitotoksik etkileri albumin varlığında tamamen nötralize edilmiştir.

Bu sonuçlar albuminin lipid peroksitleri bağlayarak ve sitotoksik etkilerini nötralize ederek sperm plazma membranını peroksidatif hasardan koruduğu hipotezini desteklemektedir. Nötralizasyon mekanizmaları bu proteinin bir veya birkaç değişik antioksidan özelliğini kapsamaktadır. Albumin sadece fosfolipaz tarafından serbestleştirilen lipid peroksitleri bağlamakla kalmaz bunun yanında lipid peroksidasyon kaskatını da bozar bunuda ya temizleyici bir antioksidan gibi davranarak ya da geçiş metallerini bağlayan bir şelatör gibi davranarak gerçekleştirir. Bir diğer olasılık da albuminin peroksidaz aktivitesi göstermesi olabilir. İndirgenmiş glutatyon gibi, tiyol indirgeyen equvalantlar olması şartıyla albumin lipid hidroperoksitleri benzer alkollere çevirir. Başka bir şekilde albumin , nitrik oksitle yine insan spermatozoasının ürettiği bir ürün olan süper oksit iyonunun reaksiyonu sonucu oluşan peroksinitrit gibi sitotoksik ürünleride temizlemektedir.

NADPH'nın indüklediği endojen ROS üretimi sperm plasma membranına peroksidatif hasar vermekle kalmaz aynı zamanda önemli miktarda DNA hasarına da neden olur. NADPH verildikten sonra artan bu DNA hasarı PVA ve albuminin her ikisinin birden varlığındada devam etmiştir. Albuminin NADPH'nın indüklediği DNA hasarını önleyememesindeki sebebi bu çalışmada sorumlu oksijen metabolitinin okside lipidden çok hidrojen peroksit olmasıdır çünkü albumin hidrojen peroksitin indüklediği DNA zincir kırıklarını inhibe edemez. Halbuki albumin insan spermatozoasında glutatyon peroksidaza antagonist olarak davranan ve lipid peroksidasyonunu artıran merkaptosüksinat üzerinde dramatik bir inhibitör etkiye sahiptir. Bu gözlem şöyle açıklanabilinir; dinlenme fazındaki hücrede glutatyon peroksidaz DNA'yı oksidatif saldırıdan korumak için plasma membranından fosfolipaz A2 tarafından salınan lipid peroksitleri aktif olarak temizler. Glutatyon peroksidaz aktivitesinin merkaptosüksinatla bastırılması yapısal olarak oluşan peroksitlerin plasma membranından kısıtlanmayan bir geçişle kromatine ulaşmasına ve de DNA zincirinde kırıklara sebebiyet verir. PVA ve merkaptosüksinatın her ikisinin birden varlığında DNA'daki hasar o kadar çoktur ki, ortama NADPH ilavesi ek bir DNA hasarına sebep olamaz. Halbuki albumin varlığında bu, membrandan köken alan peroksitler merkaptosüksinatla glutatyon peroksidaz aktivitesi bastırılmış olsa bile bir şekilde yakalanır ve sperm nükleusuna geçemez ve DNA hasarına sebebiyet veremez.

Aşağıdaki gözlemler bu hipotezle uyumludur. (i) Lipid peroksitler fosfolipaz A2 aktivasyonuyla sperm plasma membranından spontan olarak üretilir ve salınırlar (ii) Lipid peroksitler DNA hasarını indükleme kapasitesine sahiptirler. (iii) glutatyon oksidazın bir formu olgun spermatozoa da fosfolipid hidroperoksitlere karşı aktiftir ve (iv) spermatozoada glutatyon peroksidaz nükleusla sıkı bir birliktelik içindedir.

Özet olarak bu çalışmada, ekzojen NADPH kullanılmasının, artmış intraselüler toksik oksijen metabolitleri üretiminin sperm disfonksiyonuna sebep olduğunu gösteren bir model oluşturulmasında potansiyel bir değere sahip olduğu vurgulanmıştır. ROS'un kaynağı intraselüler olduğunda süperoksit dismutaz, katalaz veya hipotaurin gibi ekstraselüler oksidatif hasara karşı son derece etkili olan klasik antioksidanların işe yaramadığı görülmüştür. Halbuki %0.3'den %10'lara varan dozlarda albumin intraselüler olarak üretilen oksidatif streste sperm motilitesini korumada müthiş bir yeteneğe sahiptir.

Albumin lipid peroksidasyonunu önlemez fakat lipid peroksitleri bağlayarak sitotoksik etkilerini nötralize eder. Bu protein ilavesi ayrıca, merkaptosüksinat tarafından glutatyon peroksidaz aktivitesinin bastırılmasında da sperm DNA sını oksidatif hasardan korur. Buna rağmen NADPH tarafından indüklenen DNA hasarında koruyucu bir etkisi yoktur. Bu çalışmalar albuminin bir antioksidan olarak yardımcı üreme protokollerinde insan sperm fonksiyonunun korunmasındaki önemi ve sınırlarını vurgulamaktadır.

Twigg J, et al: Hum Reprod 13: 1429-36, 1998.

SERBEST RADİKALLER, ANTİOKSİDANLAR VE SPERMATOZOA İLE KLİNİK İLİŞKİLER

Son yıllarda, fertilite potansiyeli ile ilgili olarak oksijen toksisitesi ve serbest radikal reaksiyonlarının etkisini kabul eden ilgi artmıştır; superoksid radikaller (O2-), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikal (OH-)'in hücre lipid membranında peroksidatif hasara yol açması gibi. Lipid peroksidasyonuna en hassası poliansature yağ asitleridir, bu muhtemelen komşu hidrojen atomundaki karbon-hidrojen bağını zayıflatan karbon-karbon çift bağının olmasına bağlıdır. Lipid peroksidasyonu; membran bütünlüğünün yok olmasına, hücrenin elektrolitlere permeabilitesinin artmasına neden olur. İçeri özellikle kalsiyum ve sodyum iyonlarının geçişi hücrenin ATP-tüketen hale gelmesine neden olarak hücrenin enerji oluşturan mekanizmasını etkileyebilir. İntraselluler kalsiyum iyonlarındaki artış; protein ve lipidlerde daha fazla hasara neden olabilecek proteaz ve fosfolipazı aktive eder. Bu serbest radikal aracılı yöntem aynı zamanda DNA'ya yapısal hasar ile hücre ölümüne neden olabilecek enzim inkativasyonuna neden olabilir (Halliwell 1994: Cummins et al, 1994).

Memeli spermatozoasının yüksek oksijen konsantrasyonu ile oluşacak hasarlara çok hassas olduğu bilinmektedir (Aitken ve Clarkson 1987). İnsanda spermatozoanın fosfolipidlerindeki poliunsature yağ asidleri peroksidasyona çok yatkın olduğu için, spermatoza tarafından oluşturulan serbest oksijen radikallerinin (ROS) spermisidal sitotoksik son ürünlerin oluşumuyla ilgisi olabilir (Selly et all, 1991). Anormal ROS'ların oluşumunun erkek infertilitesi ile ilgili olduğu düşünülmektedir; lipid peroksidasyonu ile spermatozoa fonksiyonları bozulur, membran fonksiyone değildir, ayrıca bozulmuş metabolizma, morfoloji, motilite ve sonuçta infertilite oluşur (Cummins et al, 1994).

Subfertile erkeklerin spermlerindeki ROS kaynağının, kendi spermatozoaları mı yoksa infiltre lökositlerden mi kaynaklandığı tartışılmaktadır (Aitken ve West, 1984; Aitken ve Clarkson 1987). Sperm disfonksiyonu; spermin Sertoli hücresinden salınımı sırasında veya kusurlu spermiasyondan kaynaklanabilir (Russell, 1991). Spermatozoanın fazla sitoplazmasını atması zorunludur. Mevcut, atılmamış sitoplazmik dropletlerin varlığı azalmış fertilite ile ilgilidir. ROS oluşumu ile spermatozoadaki reziduel sitoplazm arasıda, sitoplazmik glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (6 6PDH) üreten nikotinamid adenin dinüklid fosfat (NADPH) üzerinden, ki sonrasında ROS kaynağı olarak görev yapar, bir bağ bulunabilir (Cummins et al, 1994).

Kreatin kinaz konsantrasyonu, spermatogenezin son fazı sırasındaki fazla sitoplazmanın atılması (extrusionu) derecesini gösterir (Huszar ve Vigue, 1994). Huszar ve Vigue (1994) sperm kreatin kinaz aktivitesi oranları ile semende lipid peroksidasyonu arasında yakın ilişki olduğunu bulmuşlardır. Bununla birlikte bu model için tek sınırlama spermatozoanın NAPDH oksidaz içermesidir (Ford, 1990). Lökositler semendeki ROS için potansiyel kaynaktır.

Fagositozu takiben nötrofiller, monositler ve makrofajlar bir oksijen tüketimi patlaması oluştururlar. Pentoz fosfat yolunun aktivasyonunun neden olduğu bir glukoz katabolizmasında artış vardır. Bu olay "Respiratuar burst" olarak adlandırılır ve ROS'un üretim ve salınımıyla alakalıdır (Babior et al, 1976). Semende spermatozoa yanı sıra lökositler, özellikle nötrofiller, de bulunabilir. Oksidatif hasarlardan şayet bu infiltre lökositler sorumluysa, o zaman antibiyotik tedavisi anlam kazanmaktadır. Ama anoral spermatozoalar da ROS salınımı yapabildiklerinden, ek olarak antioksidan tedavi de değerlidir.

Spermatozoanın lipid peroksidasyonunu önlemekteki yeteneği, normal fonksiyonunu sağlamak ve hücre membranının stabilitesi için kritik önem taşır. Teorik olarak lipid peroksidasyonu, O2- ve H2O2 seviyelerini sınırlayacak metal katalistlerin varlığını sınırlayarak ve reaksiyon daha ilk oluştuğunda bunu hızla önleyerek kontrol altına alınabilir. İntra ve extraselluler oksidasyondan koruyucu sistemler süperoksit anion ve diğer reaktif oksijen türevlerinin zararlı etkilerini önlerler (süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz-reduktaz sistemi) (Li, 1975; nissan ve Krysel, 1983; Jeulin et al, 1989). ROS'un sitotoksisitesi, onların oluşum ve atılım oranları arasındaki hassas denge ile kontrol altında olduğu açıktır. Bu dengedeki en ufak değişiklikler hücresel hasara neden olabilir. Tekrarlanan santrifüj nedeniyle sperm yıkanması sırasında ROS konstrasyon seviyesi 20-50 kat artabilir (Worren et al, 1987).

Spermin hazırlanması sırasında seminal plazmanın atılımı seminal plasmada bulunan oksidasyondan koruyucu addeleri uzaklaştırmış olacağından, ROS'un rahatça zarar göstermeye devam etmesine neden olabilir. Dahası lipid peroksidasyonunda oluşan temel reaksiyonlar demir ve bakır iyonlarıyla katalize olurlar (Hallwell ve Gutteridge, 1990). Bu reproduktif teknikler için önemli olabilir. Huszar ve Vigue (1994) Percoll fraksiyonlarında semende ölçülenden yaklaşık %40 daha fazla malondialdehit (MDA) açığa çıktığını bulmuşlardır. Bu Ham'daki F-10'dan kaynaklanan demir ve bakırdan ve lipid peroksidasyonunu arttıran Percoll'den dolayı olabilir.

Erkek infertilitesine özellikle demir ve bakır gibi metal iyonlarının olası etkisi önemli bir konudur. Semendeki metal iyonlarının artmış seviyesi erkek infertilitesinde önemli ve pozitif yönde korele gibi görünmektedir (Menditto et all, 1997).

Dawson ve arkadaşları (1992) askorbik asid vermenin ağır tütün içenlerde sperm kalitesini arttırdığını göstermiştir. Yakın zamanda, Menditto ve arkadaşları (1997) düşük askorbat seviyeleri ve sperm hasarının, bakır iyonları gibi katalitik olarak aktive metallerin varlığı ile ilişkili olduğunu bildirmişlrdir. Bazı patolojik durumlarda ve sigara içimi konularında olduğu gibi artmış bakır bazı durumlarda önemli olabilir. Lenzi (1993) infertil hastalarda glutathione tedavisinin etkisini inceledi. Sperm motilite ve morfolojisinde istatistiksel olarak anlamlı bir pozitif etki gözlemlediler.

Yardımcı üreme tekniklerinde sperm hazırlığı için santrifüj kullanılmaktadır. Santrifüj işleminin ROS oluşumuna sebep olduğu, sperm fonksiyonları üzerine zararlı etkisi bulunduğu rapor edilmiştir (Warren, 1987). Perinaud (1997) santrifüjasyonla oluşan hasarın antioxidanları içeren bir tuz çözeltisi kullanıldığında önlendiğini göstermiştir. Onun için spermatozoa'yı likefaksiyon ve santrifüj sırasında antioksidan içeren solüsyonla tedavi etmek daha fazla motil spermatozoa elde edilmesinde önemli bir faktör olabilir.

Fazla ROS oluşumu defektif sperm fonksiyonuyla ilişkilidir (Aitkan ve ark. 1989, Iwasaki ve Gagnon 1992, Mazzilli 1994, Suckharoen 1996). Iwasaki ve Gagnon, infertilite kliniğine başvuran erkek hastaların %40'ında semende ROS formasyonu bulunduğunu görmüştür. Mazzilli (1994) anlamlı olarak yüksek süperoksid seviyeleri bulmuştur. Bu oranlar normospermik infertil erkeklerde %87, fertil normospermiklerde ise %55'dir. Huzsar ve Vigue (1994) normospermik erkeklerin %12'sinde yüksek alondialdehit oluşumuna ait deliller bulmuşlardır. Bu bilgi göstermektedir ki, ROS oluşumundaki yüksek insidansın hem infertil hem de fertil erkeklerde sperm fertilize edici potansiyelini düşürmekle ilgisi olabilir. Dahası ROS'un spontan formasyonunun azalmış sperm-oosit etkileşimi ve azalmış in-vivo fertilite ile alakası vardır (Aitkan ve Clarkson 1987, Aitkan 1989). Aitken ve Clarkson (1987) göstermiştir ki, spermatozoa'nın ROS üretimi ile sperm-oocyte birleşimi yeteneği arasında ters ilişki vardır. Yüksek lipid peroksidasyonu spermin akrozomal reaksiyona girme ve fertilite etme kapasitesini azaltabilir (Aitken, 1989).

N-formly-metionail-leucyl-fenilalanin (FMLP) ile stimulasyondan sonra ROS oluşumu ile invitro fertilizasyon (IVF) arasında büyük ilişki vardır ve IVF sonucu hakında önceden bilgi verici öneme sahiptir (Sukcharoen 1996). Bunun etkisi, membran akıcılığının azalmasından veya sekonder-messenger sistemler gibi akrozomal reaksiyona öncülük eden bazı biyokimyasal yolların selektif inaktivasyonundan ötürü olabilir (De Jonge 1991). Başka bir çalışmada Aitken, artmış ROS üretimi gösteren oligozoospermik hastaların %50'sinde spontan hamilelik insidansı ile ROS oluşumu arasında negatif korelasyon olduğunu gözlemiştir. Rao (1989) lipid peroksidasyon potansiyeli ile spermatozoa'nın morfolojik anormalileri, öncelikle de kuyruk kusurları arasında korelasyon olduğunu göstermiştir. Barmot (1994) dithiothreitol'un baş defektlerinde (anormal geniş sperm başı) belirgin artışa sebep olduğunu bulmuştur. Iwasaki ve Gagnon (1992) ve Mazzilli (1994) ayrıca superoksit anyon seviyeleri ile sperm morfolojik anomalileliri arasında pozitif korelasyon olduğunu da rapor etmişlerdir.

Antioksidan savunma mekanizmaları hem intrasellülar (superoksit dismutaz, katalaz, glutatyon, peroksidaz, ferritin) hem de extrasellülardır (transferrin, laktoferrin, seroloptazmin, haemopexin, haptoglobin ve albumin). Bu antioksidanlara rağmen, belirli bazı serbest radikallerin kurtulup, hasara yol açma yetenekleri de vardır. Böylece DNA kalıcı "oksidatif hasara" uğrar. Eğer hidroksil radikalleri DNA'ya yakın oluşursa, purin ve pirimidin bazlarına saldırarak mutasyonlara sebep olabilirler. Endojen kaynaklı antioksidan şansımız tam olarak effektif olmadığından, in-vivo oxidatif hasarı azaltabilecek diyet antioksidanlardır (vitamin E, C, b-karoten, flovanoidler) (Halliwell, 1994). Dahası antioksidan terapi vermek spermin kalitesini de geliştirebilir. IVF tedavilerinde düşük fertilizasyon oranları olan fertil, normospermik erkeklerde yüksek malondialdehit prodüksiyon oranları görülür. Antioksidan terapi (vitamin E) ile lipid peroksidasyon potansiyeli (MDA)'nin azaltılması; fertilizasyon oranlarının gelişmesiyle paralellik gösterir (Geva, 1996).

İn-vivo E vitamini kullanımı; serbest radikallerin neden olduğu aşırı oksidasyondan dolayı nuclear kromatin bozukluğu gelişen hastaların fertilizasyon potansiyellerini artırabilir (Gazit-Rajuan 1996).

Dawson (1992) askorbik asit vermenin; ağır tütün içildiğinde sperm kalitesini geliştirdiğini göstermiştir. Lenzi (1993) infertil hastalarda glutatyon terapisinin etkisini araştırmış olup sperm motilitesi ve morfolojisi üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir pozitif etki belirlemişlerdir.

Sonuç olarak, (1) Sperm fertilite edici potansiyelini önceden belirlemekte oksidasyonu gösteren biyokimyasal markerlar (e.g. malondialdehit gibi) sperm analizinden daha faydalı olabilirler; (2) İnfertil çiftlerde E vitamini veya askorbik asit gibi antioksidanların takviyesi gözönünde bulndurulmalıdır; (3) Yardımcı üreme tekniklerine hazırlıkta likefaksiyon ve santrifüj sırasında spermatozoa'yı antioksidanları içeren solusyonlar kullanarak korumak; (4) Serbest oksijen radikalleri, ICSI sırasında DNA hasarı yaparak, fertilizasyonu bozabilir.

Geva E, et al: Hum Reprod 13: 1422-24, 1998.

ERKEK SUBFERTİLİTESİNDE OLASI BİR UYGULAMA: ANTİOKSİDAN TEDAVİ

Macleod'un 1943'de insan spermatozoolarının oksijen altında inkübasyonunun toksik olduğunu göstermesinden beri reaktif oksijen radikallerinin (ROS) in-vitro haraplayıcı etkisi tartışmasız olarak bilinmektedir. Xantin / xantin oksidaz veya kontamine olan beyaz küreler yolu ile oluşan ROS'lar, spermatozooların zonasız hamster yumurtalarıyla birleşme yeteneklerini veya akrozom reaksiyonunu etkiler ve sperm motilitesini bozabilir. ROS'ların bu etkisini azaltmak için E vitamini gibi antioksidanlar veya hidroksibutiltoluen kullanılmasının ROS'un in-vitro spermatozoa hasarına karşı koruyucu etkisi açık olarak ortaya konulmuştur (1998 Aitken ve arkadaşları, Alvarez ve Storey 1989, Lamiranda ve Gagnon 1992, Griveau ve arkadaşları 1995, Ford ve arkadaşları 1997).

Bazı erkeklerin ejakulatlarından hazırlanan sperm süspansiyonlarında ROS oluşabilir ve infertil erkeklerde bu oluşumun sıklığı normal populasyonda tahmin edilenden daha fazladır (Ford ve arkadaşları 1997). ROS oluşumundaki artış çoğunlukla oligozoospermi ile birlikte görülmekte olup, zonasız hamster yumurtlarını fertilize edebilme yeteneğinde azalma ile ilişkilidir (Aitken ve arkadaşları 1991). Sperm süspansiyonlarındaki ROS'nin temel kaynağı kontamine olan lökositlerdir (Aitken 1992, Kessopoulou 1992, Krausz 1992, Ford 1995). İn-vitro fertilizasyon çalışmaları sonuçlarını artırmak için ortama E vitamini veya Sperm-Fit eklenmesi veya ortamdaki lökositlerin antikorlar ile uzaklaştırılmasını içeren pek çok araştırma yürütülmektedir (Aitken 1996, Parinaud 1997).

Subfertil erkeklerde antioksidan tedavi kullanılması tartışmalıdır. Bunun etkili olduğunu düşündüren nedenler; (i) kadında veya erkekte olsun spermatozoa reprodüktif traktta savunma mekanizmalarını aşacak kadar fazlalıkta oksidatif strese maruz kalmaktadır; ve (ii) oral antioksidan tedavisi verilmesi spermatozoadaki ve reprodüktif kanaldaki antioksidan seviyeyi artırabilir.

Subfertiite ile ilgili olarak erkek reprodüktif sisteminde spertmatozoa üzerine oksidatif zarar gelişmiş olma olasılığı ile ilgili lehte ve alehte kanıtlar vardır. Bazı gözlemler ortaya koymuştur ki; ROS'a karşı koruyucu önlemler glutation peroksidazın spesifik bir formu olan ve epididimde bulunan yüksek konsantrasyondaki süperoksit dismutazdır (Perry ve ark. 1992,1993). Spermatozoolar yeterli konsantrasyonlarda antioksidan enzimler içermektedirler (Ford ve ark 1997). Bu önlemlerin bulunması peroksidasyonun önlenmesinin önemini vurgulamaktadır. Ayrıca, epididimin semene lökosit geçmesinde ana yol olması ( Wolf 1995 ) ve oligospermik kişilerde epididimal geçişin uzamış olması (Johnson ve Varner 1998) semende ROS'nin artması ve sperm fonksiyonlarının azalması ile uyumludur. Epididimal ROS'a maruz kalma süresinin arttığı zamanlarda sperm kalitesi de azalmaktadır (Multinger ve spira 1997). Son olarak, sperm lipit peroksidasyonu bildirilmiştir. İnsan semeninde lipit peroksidasyonun son ürünü olan (E)-4-hidroksi-2-noneal bulunmaktadır, ancak bunun tek kaynağının spermatozoa olduğunu gösteren açıklayıcı kanıtlar yoktur (Selley ve ark. 1991) Demir ve askorbik asit ile muamele edildiğinde oligozoospermik kişilerde normospermik kişilerden daha fazla malondialdehit bulunduğu görülmüştür ki bu lipit peroksidazın, membranda biriktiğine işaret eder (Aitken ve ark 1993). Astenozoospermik kişilerin spermatozoolarında, lipit peroksidasyonunun artışına işaret edecek düzeyde, normal kişilerden daha yüksek miktarda malondialdehit vardır (Suleiman ve ark. 1996).

Sonuç olarak, subfertiliteye neden olabilecek korunma mekanızmalarında bozulmalar bulunduğuna ait kanıtlar vardır. İnfertil kişilerde semen plazmasında, fertil kişilerden daha az antioksidan kapasite mevcuttur (Lewis ve ark 1995) ve zayıf motiliteli spermlerin membranında E vitamini konsantrasyonu az olup bu oran lökosit konsantrasyonu ile ters orantılıdır (Theron ve ark. 1996).

Madem lökositler ana ROS kaynakları ise ve epididime geçebiliyorlar ise, semendeki lökosit konsantrasyonu ile sperm lipit peroksidasyonu ve sperm disfonksiyonu ile arasında bir bağlantı olmalıdır. İn-vitro çalışmalarda, lökosit konsantrasyonu ve ROS üretimi arasında (Aitken ve ark. 1992) ve ROS üretimi, lipit peroksidasyonu ve fonksiyon kaybı arasında açık bir bağlantı vardır (Alvarez ve ark. 1987, Griveau ve ark. 1995). Yine de, lökositlerin semene geçme oranları ve fertilite oranları arasındaki bağlantı çelişkilidir. Bazı çalışmalar infertilite ile ilgili olarak yüksek lökosit sayımları bulmuş (Wolff ve ark. 1990) olmalarına rağmen, bazı çalışmalarda ise bunun etkisinin olmadığı hatta sperm kalitesini iyi yönde etkilediğine dair sonuçlar alınmıştır (Tomlinson ve ark. 1993). Bu konu Wollf (1995 ) tarafından işlenmiştir. Aitken ve ark. (1994-1995) lökosit ROS'unun spermatozoolara zararlı olduğunu bulmuşlarsa da in-vitro süspansiyonlarda semendeki lökosit miktarı ile spermatozoa motilitesi arasında ve akrozom reaksiyonları ve zonasız hamster yumurtaları ile birleşme yetenekleri arasında, her ne kadar ROS yapımı ile lökosit konsantrasyonu arasında bir bağlantı var ise de, bir bağlantı bulamamışlardır.

Bu sonuçlara göre epididimde lökosit olmaması, varsa bile ROS üretmek için aktive olmadıkları veya epidimal koruma mekanızmalarının spermatozooları korudukları olası açıklamalardır. Bu sebeblerle semen süspansiyonlarında oluşan ROS'nın erkek üreme sistemindeki oksidatif stres etkisi tartışmalıdır. Bu sebeple anahtar soru antioksidan tedaviye karar vermekte ROS üretiminin bir kriter olabilirliliğidir. Bu tür çalışmalar sperm antioksidan düzeyini, sperm konsantrasyonunu, absinens süresini ve diğer faktörleri içermelidir. Oksidatif stresin dişi reproduktif sistemeindeki spermatozolar üzerine etkisi ve bunlarda antioksidan kapasitenin artırılması hakkında bir bilgiye de sahip değiliz.

Diğer bir önemli soru da, oral antioksidan tedavinin erkek reprodüktiif sistemde antioksidan düzeyi arttırıp artırmadığı ve sperm fonksiyonlarını iyi yönde etkileyip etkilemediğidir. E ve C vitaminleri ve glutatyon bu amaçla ileri sürülen ana maddelerdir. E vitamini lipit peroksidasyonu zincir reaksiyonunda sonlandırıcı bir role sahiptir. C vitamini ise ROS ile direkt reaksiyona girebildiği gibi, tokoferol'ü tekrar aktif form a-tokoferole çevirerek miktarını da azaltmaktadır. Bu, seminal plazmada yüksek konsantrasyonda bulunur, ancak yüksek miktarda ROS bulunan ve anormal spermatozoa oranı yüksek olan örneklerde nisbeten azalmıştır (Thiele ve ark. 1995). Aynı zamanda bu madde sperm DNA'sını oksidatif hasardan korur (Fraga ve ark. 1991).

Glutation antioksidan olarak görev yapabilirse de, aslen glutation peroksidazın bir kofaktörüdür.

Günde 300 mg E vitamininin semende E vitamini düzeyini artırdığı gösterilmiş ise de (Moilen ve ark.1993) günde iki defa 300 mg E vitamini uygulamasının önemli ölçüde seminal plazmada artış sağlamadığı da bildirilmişiitir (Kessopoulou ve ark. 1995). Çalışmalarda günlük 400 mg E vitamini+500mg C vitamini verilerek serum düzeylerinde belirgin bir artış sağlanmasına rağmen semende de birlikte E vitamini düzeyinde belirgin bir artış sağlanamamıştır (Whittington 1997). Bununla beraber artık seminal plazma E vitamini konsantrasyonunun sperm membranı konsantrasyonunu yansıtmadığı da bilinmektedir (Therond ve ark. 1996). Kessepoulou 1995'de antioksidan konsantrasyonun etkisi olmamasına rağmen spermatozoanın zona pellusidaya yapışma özelliğinde belirgin bir artma yapacağını ileri sürmüştür. Ancak halen oral uygulama ile sperm E vitamini düzeyini artırmaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. Bunula beraber E vitamini bazı astenospermik kişilerde lipit peroksidasyonunu azaltarak sperm motilitesini artırsa da, lipit peroksidasyonuna etki edemediği durumlarda motilitede düzelme olmamıştır (Suleiman ve ark. 1996). Oral glutation sınırlı etkiye sahip olsa da parenteral uygulama ile varikoseli ve genital trakat inflamasyonu bulunan kişilerde motiliteyi artırmış ve doymamış yağ asitlerinin serum ve eritrosit konsantrasyonunu yükseltmiştir.

E vitaminin oral uygulaması ile sperm membranında düzeyin artması ve oksidatif strese direnci arttırdığını göstermek için ileri çalışmalar yapılmalıdır. Böylece Kessopoulou ve ark.'nın (1995) ve Suleiman ve ark.'nın ( 1996 ) ümit verici sonuçları için geçerli bir teorik baz sağlanabilir. E vitamini C vitamini ile birlikte verildiğinde daha etkili olmakta ise de, bu konunun doğrulanması gerekir. Aynı zamanda glutation enjeksiyonunun sperm glutation düzeyine ve lipid peroksidasyonu üzerine etkisi dearaştırılmalıdır.

Sonuç olarak, oral antioksidan tedavisinin erkek infertilitesinde yarar sağlayabileceğine ilişkin ümit verici kanıtlar vardır. Bunu onaylamak için büyük ölçekli, çitf-kör, plasebo kontrollü çalışmalar yapılmalıdır. Spermatozoaların erkek veya dişi reprodüktif sisteminde oksidatif strese maruz kaldığını ve bunun sonucunda lipit peroksidasyonuna veya başka bir hasara uğradığını ve E vitamininin sperm membranında antioksidan kapasiteyi artırdığını ispatlamak için daha çok bulguya ihtiyacımız vardır. Bu bilgi bize tedaviden fayda görmesi muhtemel hastaların seçimini sağlayacaktır. Oksidatif stres veya lipit peroksidasyonuna bağlı olamayan infertilitede E vitamininin faydası belirsizdir. Eğer E vitamini tedavisinin etkinliği tam olarak ortaya konabilirse bu umut verici vaat tamamlanmış olur; zira erkek infertilitesi hakkında pek çok yanlış umutlar vardır.

Ford WC, et al: Hum Reprod 13: 1416-19, 1998.

ANTİOKSİDAN TEDAVİ, İNFERTİLİTE TEDAVİSİNDE ÜMİT VERİCİ BİR YÖNTEM

Antioksidanlar infertiliteye karşı korur.

Uzun zamandır bilindiği üzere, kültür ortamlarına reaktif oksijen türleri (serbest oksijen radikalleri, ROS)'ne karşı antioksidanların eklenmesi, disülfit redükte edici ajanları veya divalant katyon şelatörlerini temizler; (i) in vitro olarak fare 2-hücre bloklarını korur (Noda 1992, Johnson ve Nasi-Esfahani 1994 ), ( ii) erkeklerde pronuklear formasyonu indükler ve blastosist evresine gelişimi domuzlarda artırır. ( Yoshida ve ark. 1993, Grupen ve ark. 1995, Savar 1997 ), aynı etki bovin sığırlarda da vardır. ( Takashi 1993, Caomano 1996 , De Matos 1996 ), (iii) fare örneklerinde de, klivaj oranlarını ve yavaş soğutma tekniğinde, dondurma-çözme işlemi stresine toleransı artırır. ( Tarin ve Trounson 1993 ) , (iv) dondurma-çözme işlemi sonrası reaktive edilen boğa spermatozoolarında motiliteyi uzatır. ( Lindemann 1995 ), (v) blastosist evresine kadar en azından bir bölümünde, in vitro fertilizasyondaki oosit yaşlanmasının negatif etkisinden , sellüler fragmantasyon gelişiminden korur ( Tarin ve ark. 1998 ), ( vi ) in vitro mature olmuş fare oositlerinde throloxidizing ajanların diamidin kromozomal dağılım ve metafaz II-ağları üzerindeki zarar verici etkisi ile mücadele eder. ( Tarin 1998 )

Antioksidan tedavi sadece in vitro değil aynı zamanda iv vivo da etkilidir. A vitamini (retinoidler ve carotenoidler), E vitamini (a-tocoferol) ve/veya askorbik asit alımının laboratuar koşulları ve hayvanlar üzerinde, reproduksiyonu artırdığına ilişkin deliller vardır ( Hurley ve Doane 1987 , Chew 1993 , Luch 1995 ).

Fare modellerinde C ve E vitamini karışımlarını diyetle artırarak gösterilmiştir ki (i) eksojen over stümülasyonlarında, yaşlanma ile ilgili ovulasyon düşüşünü engeller (JJ Tarin, J.Ten, F.J.Vendrell ve A.Caro, yayımlanmamış bilgi) ve (ii) maternal yaşlanmanın MII ağlarındaki kromozom dağılımı ve oositin ilk mayoz bölünmesindeki kromozom ayrımına olan zararlı etkisini nötralize eder ( Tarin ve ark. 1998 ).

Antioksidanların reproduktif fonksiyonlar üzerine laboratuar ve hayvanlar üzerindeki bu etkisinin bilinmesine rağmen, antioksidan tedavinin in vitro ve insan gamet fizyolojisi üreme etkileri üzerine çok az çalışma yapılmıştır. Spermatozoolar üzerindeki in-vitro çalışmalar göstermiştir ki; kültür ortamının antioksidanlar ile zenginleştirilmesi, defektif spermatozooa ve PMN lökositlerce üretilen ROS'un motilite üzerindeki (-) etkisini nötralize eder ve spermatozoanın ferröz ionlarla tedavisi sonrası, sperm-oosit füzyonunu artırır (Livine 1996 , Parinaud 1997).

Oosit konseptindeki in-vitro çalışmalar götermiştir ki; fertilizasyonun gelişiminde askorbik asit eklenmesinin bir etkisi yoktur (Tarin ve ark. 1994). Daha önce değinildiği gibi, fertilizasyon gelişimine askorbik asitin bir etkisinin olamamasının nedeni, diğer faktörler yanında kısa süreli kültür kullanılması olabilir. Özellikle konseptler kültür ortamında 3 güne kadar tutulmuşlardır (inseminasyon sonrası 64-66 saat arası). Bu noktada, askorbik asitin in-vitro olarak spontan klivaj duraklaması üzerine etkisini ölçmek mümkün değildir ki, bu durum insanlarda 4 ile 8 hücreli evreler arasında olmaktadır (Brauda ve ark. 1988).

İnsanlarda in-vivo çalışmalarda, antioksidan tedavinin, sigara tiryakisi olanların sperm kalitesini artırdığı gösterilmiştir (Dawson ve ark. 1992). Ve aynı zamanda erkek kökenli infertilitede (Lenzi ve ark. 1993) semende yüksek miktarda ROS bulunan sağlıklı insanlardaki kadar (Keeopoulou ve ark. 1995) sperm kalitesini artırdığını göstermişlerdir. Sperm kalitesini önceden in-vitro fertilizasyonda düşük oranlar elde ediliş olan fertil noormozoospermik insanlarda da arttırır (Geva ve ark. 1996). Aynı zamanda anovulatuar kadınlarda ki klomifen kullanımının ovulasyon indüksiyonundaki etkisi, oral 400mg /gün askorbik asit eklenmesi ile de artmaktadır (Igashi 1977).

Antioksidan tedavi, iki ucu keskin bir bıçaktır, özellikle güvenli dozaj aşıldığında, negatif ve istenmeyen etkileri ortaya çıkabilir. A vitamininin yüksek dozda alınması, nöral krest veya tüp, muskuloskeletal veya ürogenital anomalileri de içeren, embriyotoksik ve teratojenik etkiler oluşturabilir (Meyers ve ark. 1996, Hathcock 1997). Yüksek miktarda karoten içeren bitkiler, östrajenin fekal olarak atılımını artırır ve östradiol'ün kan seviyesini düşürerek amenoreye neden olabilir (Martin-Dupan ve ark. 1990). Yüksek dozda askorbik asit ovarian steroidogenezi inhibe edebilir (Leure ve Morita 1985), fertilitenin azalmasına (Igashi 1977) ve abortus olasılığının artışına neden olabilir (Pintauro ve Bergan 1982). Yüksek miktarda maternal askorbik asit alımı, insanlarda ve domuzlarda fötal askorbik asit metabolizmasını artırır (Blom ve Dabrowski 1996). Bu maternal etki, yeni soylarda yeterli askorbik asit alımına rağmen skorbüt'e neden olabilir. Askorbik asitin plazma saturasyonu günlük 1000mg ile sağlanır (Lewine ve ark. 1996), daha yüksek dozlar, oxalatın fazla atılımına bağlı olarak, böbrek taşı oluşumunu artırır. Skorbüt ve okzalat taşı oluşumunun yüksek miktarda askorbik asit alımına bağlı olduğu düşünülse de tam olarak doğrulanmamıştır. ( Hathcock 1997 )

Tüm iyi ve kötü yönlerine rağmen, antioksidan tedavinin reprodüktif fonksiyon ve sağlıktaki etkilerine karşı daha fazla gözlerimizi kapatamayız. İyi bir diyet düzenlemesi ile faydaları, sağlık ve fertilitedeki potansiyel istenmeyen etkilerine baskın gelecektir. Antioksidan tedavi uzun zamandır bilinmekte idi ve artık daha da göz önüne gelmiştir İnsan reprodüktif tıbbında bu tedavi bir koruyucu yöntem olarak kabullenilmelidir.

Tarin JJ, et al: Hum Reprod 13: 1415-16, 1998.

GLUTATYON TEDAVİSİ

Serbest oksijen radikal sistemlerinin ve perokside olabilen maddelerin membran seviyeleri (poliansature yağ asitleri - PUFA - gibi) hücresel homeostazisin düzenlenmesinde etkili olan faktörlerdendir. Buna bağlı olarak, oksidatif stres aslında prooksidan ve antioksidanlar arasındaki dengenin bozulmasıdır. Matür spermatozoada yüksek konsantrasyonda membran ansatüre lipidleri ile rölatif düşük konsantrasyondaki oksiradikal enzimler (süperoksit dismutaz - SOD, katalaz ve glutatyon peroksidaz gibi) belli bir interaksiyon içindedirler (Aitken, 1991). Bu düşük konsantrasyon muhtemelen matür sperm hücrelerindeki sitoplazma eksikliği nedeniyledir. Bu durum, seminal plazmadaki güçlü antioksidan sistem tarafından kompanze edilmektedir. Yapılan birkaç çalışma göstermiştir ki; birçok biyolojik sıvıdakinin aksine seminal plazmada, SOD, ksantin oksidaz, nitrik oksit, katalaz, glutatyon peroksidaz, askorbik asit (vit. C) ve alfa-tokoferol (vitamin E) gibi antioksidanların belirgin olarak yüksek düzeylerde olduğu tespit edilmiştir (Daunter ve ark., 1981; Sanoka ve ark., 1996; Theront ve ark., 1996). Ayrıca, seminal plazmada antioksidan sisteme dahil olan, redükte glutatyonun (GSH) relatif olarak yüksek konsantrasyonda bulunduğu tespit edilmiştir.

Oksiradikaller ve toksik bileşiklerin sperm fonksiyonu üzerindeki zaralı etkileri incelenirken özellikle reaktif oksijen türevlerinin (ROS) sperm fonksiyonu üzerindeki negatif etkileri üzerinde durulmuştur (Aitken ve Clarkson, 1987; Alvarez ve ark.,1987; Aitken ve ark.,1989; D'Agata ve ark., 1990). ROS, spermatozoa için toksiktir; ve sperm molitilitesini belirgin olarak etkilemektedir (Alvarez ve Storey, 1982,1989). Bununla beraber, ROS'un in-vitro olarak kapasitasyon ve ileri hızlı motilite gibi fizyolojik sperm fonksiyonlarını tetiklediğini rapor eden bazı çalışmalar da mevcuttur (de La Mirande ve Gagnon, 1993; Griveau ve ark., 1994). Kapasitasyon sürecinde spermatozoa ROS üretiminin belirgin biçimde arttığı gözlenmiştir (de La Mirande ve Gagnon, 1995). Fare ve sığır spermatozoaları üzerinde elde edilen deneysel veriler göstermiştir ki, ROS, serbest sülfidril gruplarını modifiye etmeksizin, lipoperoksidasyonu arttıran spesifik peroksidatif koşullar altında, gamet fonksiyonu açısından yararlı olmuştur (Kodama ve ark., 1996; Blondin ve ark., 1997). Bu pozitif ve negatif etkiler, ROS ve antioksidan sistemler arasındaki dengeye sıkı bir şekilde bağlıdır.

Ayrıca, semen karakteristikleri dikkate alınmadan ve sperm hazırlama metodları ile kültür kompozisyonları olguya özel olarak seçilmeden yapılan yardımcı üreme teknikleri çalışmalarında sperm seçim tekniklerine bağlı olarak çok büyük farklılıkların olduğu gözlenmiştir (Mortimer, 1991; Gavella ve Lipovac, 1994).

Genital traktdaki ROS'un ana kaynakları, spermatozoalar (özellikle anormal morfolojiye sahip ya da hasarlı olanlar), inflamatuar süreçte oluşan lökositler ve iskemi ya da hipoksi nedeni olan varikosel gibi vasküler hastalıklardır (Aitken ve ark., 1989; Gomez ve ark., 1996). Yukarıdaki bilgiler ışığında bazı disspermi olgularında, antioksidan tedavinin kullanılması önerilmiştir. Bu tedavilerin hepsi farklı bir temele sahiptir; yıllar içinde değişikliğe uğramıştır ve hepsi karnitin fosfotidilkolin, kallikrein, pentosifilin ve vit. A, E, C' yi içermektedir.

Glutatyon Antioksidan Tedavisi

Seçilmiş sperm patolojisine sahip hastalarda, glutatyon antioksidan tedavisine dayalı bu araştırma programı, 1990'lı yılların başlangıcında oluşturulmuştur. GSH'nın seçilmesindeki en önemli sebeplerden biri seminal plazmada fizyolojik olarak da bulunması idi. Hücre membranlarını geçememesine rağmen, biyolojik sıvılardaki bu antioksidan konsantrasyonu sistemik uygulama ile arttırılabilmektedir. Fizyolojik ve terapötik amacına uygun olarak, seminal plazmaya ulaşıp orada, yüksek konsantrasyonda birikmesi mümkün olmaktadır. GSH'nın thiolic grubu, direkt olarak hidrojenperoksit, süperoksit anyon ve hidroksil radikalleri ile; sülfidril grubu, alkoksil radikalleri ve hidroperoksitlerle reaksiyona girmekte ve alkolleri oluşturmaktadır. Buna ek olarak, GSH selenyum içeren glutatyonperoksidazın ve glutatyontransferazın substratıdır.

Glutatyon peroksidazın terapotik yararı ile ilgili yapılan bir pilot çalışmada (600 mg / gün, i.m), sperm morfolojisi ve sperm motilite paternleri üzerinde anlamlı istatistiksel etkiler gözleniştir (Lenzi ve ark., 1992). Daha sonra, genital trakt inflamasyonlu veya unilateral varikoselli infertil hastalar üzerinde, plasebo - kontrol gruplu çift - kör randomize bir çalışma yapılmıştır (bkz: detaylı seçim kriterleri ve istatistiksel analiz için Lenzi ve ark., 1993). Seçilen bütün hastalarda sperm konsantrasyonu, sperm motilitesi, sperm kinetik parametreleri ve sperm morfolojisinde, belirgin istatistiksel gelişme kaydedilmiştir. Bu sonuçlar, oral vit. E verilen çift - kör randomize bir başka çalışma sonuçları ile de kıyaslanmış ve desteklenmiştir (Kesso Poulou ve ark., 1995). En son aşamada, GSH'nun in-vitro etkileri ile ilgili araştırmalar da bildiriliştir. Sperm bankasındaki donör örnekleri ile, infertil hastalardan alınan semen örneklerinde (lökospermi olsun ya da olmasın) GSH uygulanan ve uygulanmayan iki grup oluşturulmuştur. Sadece GSH uygulanan lökospermik örneklerde istatistiksel olarak anlamlı sperm motilite iyileşmesi gözlendi (Gandini ve ark., 1993). Bu sonuçla, sperm motilitesinin in-vitro ortamda da GSH sayesinde hasarlı spermatozoalar, lökositler veya normal spermatozoalardan ROS'a karşı korunabileceği gösteriliştir. Son zamanlarda yapılan bir başka çalışma da, glukoz ve antioksidan olarak GSH içeren kültür ortamlarında, gelişmiş sperm motilitesinin sağlanabileceği rapor edilmiştir (Parinoud ve ark., 1997).

Eldeki bu bulgular ışığında, GSH antioksidan tedavi uygulaması ile ilgili daha somut bir protokol arayışına girilmiştir. Unilateral varikosel ya da genital trakt inflamasyonlu infertil hastalarda seçilen başka bir grup üzerinde, GSH tedavisinin etkileri iki yönden inceleniş, i) tiobarbitürik asit (TBA) yöntemiyle sperm membranı lipoperoksidasyonu riskini araştırılmış (Barber ve Bernheim, 1967; Alvarez ve Storey, 1982; Aitken ve arkadaşları, 1989). ii) kırmızı kan hücreleri membran PUFA paterni incelenmiştir. Kırmızı kan hücreleri genel olarak hücre membran durumunu temsil eden bir model olarak kabul edilir. Bu özelliği ciddi oligozoospermili hastalarda pratik olarak incelenmesi imkansız olan sperm membran fosfolipidlerindeki PUFA paternini incelemek için kullanılabilir. Bu hasta grubunda sperm konsantrasyonu, motilitesi, morfolojisi ve kinetik değişkenleri gibi parametrelerde bir gelişme gözlemlenmiştir. Bu gözlenen gelişmeler, spermatozoadaki lipoperoksit düzeyindeki azalma ve membran fosfolipitlerindeki RBC düzeyindeki artma ile ilişkilendirilmiştir. Poliansature yağ asidi (PUFA) metabolizması için değerli bir indikatör olan araşidonik asit / linoleik asit oranı hem RBC hem de serum fosfolipitlerinde tedavi öncesinde infertil hastalarda normal hastalardan alınan örneklere kıyasla daha düşük ölçülmüştür. Tedavi sonrası bu değerlerin hem RBC'de hem de semen fosfolipitlerinde artmış olduğu gözlenmiştir (bkz: detaylı bilgi için Lenzi ve ark., 1994). Bu durum, en azından göstermektedir ki; GSH'nın bu olumlu etkisi hücre membranı lipit komponentleri üzerindeki genel koruyucu etkisinden kaynaklanmaktadır. Buradan yola çıkarak kazanılmış ya da konjenital membran lipit profilindeki bozukluğa neden olabilecek desaturaz enzim eksikliği, disspermiye neden olabileceği ve GSH tedavisinin bu olumsuz durumu düzeltebileceği söylenebilir.

Seçilmiş disspermi vakalarında uygulanan GSH tedavisinin bir başka elle tutulur etkisi de epididim mikroçevresinde gelişme ve sperm plazma membranı PUFA doymamışlık oranını arttırmasıdır. Bu durum, GSH'nın epididimde bir serbest radikal gibi davranarak vasküler ya da inflamatuar olaylar sonrasında gelişen lipoperoksidasyonu azaltmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Seminal plazmadaki lipoperoksit düzeyindeki bu belirgin azalma TBA testi ile değerlendirilmiş ve hipotezimizi destekler tarzda bulgular elde edilmiştir. Bu hipotezi desteklemek için birçok değişik morfofonksiyonel farklılıklara sahip, değişik sperm populasyonları üzerinde sperm plazma membranı PUFA'ları çalışılmıştır. Gerçekte, sperm plazma membranı, fertilizasyonda temel bir rol oynamaktadır. Membran füzyonu ile ilgili günümüzdeki geçerli teorilere göre membran akışkanlığı, normal hücre fonksiyonları açısından mutlaka gereklidir. Ve bu akışkanlığı, membranın lipit komponentleri sağlamaktadır. PUFA'nın da membran akışkanlığı ve fleksibilitesine katkıda bulunduğu bilinmektedir (İsroelachvili ve ark., 1980; Fleming ve Yanagimachi, 1981; Meisel ve Turner, 1983). İnsan spermetazoa membran fosfolipidlerinin yağ asidi paterni açısından analizinde belirgin düzeyde doymamış yağ asidi seviyeleri gözlenmiştir.

Ejakulattaki spermatozoanın sahip olduğu membran lipid paterni ancak epididim pasajı sırasındaki maturasyon evresinde tamamlanmaktadır (Wolf,1986; Myles ve Primakof, 1984; Cowan ve ark.,1986; Gaunt ve ark., 1983; Hall ve ark., 1991). İnsanlardaki biyomembran akışkanlığı, artan doymuşluk derecesi ile birlikte artar, spermatozoada da caput epididimisten cauda epididimise ulaşana kadar akışkanlık ve doymamışlık derecesi artar; ki bu da aktif bir lipit metabolizmasını gösterir. Yukarıda da bahsedildiği gibi, membran fosfolipit PUFA'ları, membran fonksiyon ve durumu açısından majör role sahiptirler. Bunun yanında, lipoperoksidatif proçesin de en önemli hedefi durumundadırlar. PUFA'ların doymamışlık dereceleri, spermatozoanın bulunduğu çevredeki oksidatif equilibrium ile uyum sağlamasında esansiyel bir parametredir.

Örneğin bir çalışada ejakülattaki spermatozoa membran yağ asidi paternini incelemek için genelde kombine gaz kromatografi - mass spektrometri tekniği kullanılmıştır (Lenzi ve ark., 1994). Birinci deneyde, spermatozoa; bütün spermler ve Percoll kriterlerine göre yapılan sperm seleksiyonundan sonra elde edilen spermler şeklinde analiz edilmiştir. Bu iki gruptan elde edilen sonuçlar, PUFA yüzdelerin ebağlı olarak belirgin farklılıklar göstermiştir. Bütün spermlerin incelenmesi sonrası PUFA oranı %36 - 39, Percoll kriterlerine göre seçilen spermlerde %48 - 52 olarak ölçülmüştür. Percoll kriterlerine göre seçilen spermlerde C20:4 n6 (araşidonik asit) ve C22:6 n3 (docosaesaenoik asit) yüksek konsantrasyonlarda ölçülmüş ve normal sperm hücrelerinin karakteristik morfolojik paternini oluşturduğu gözlenmiştir (Lenzi ve ark., 1996). Bütün spermler ve Percoll kriterlerine göre seçilen spermler arasındaki PUFA yüzdesi farkı, bütün spermlere; normal olmayan spermatozoaların da dahil olmasına bağlanmıştır. İkinci bir deneyde, Percoll kriterlerine göre seçilen spermler (% 40 : 50 : 70 : 80 : 90 : 100) arasında en yüksek oranda PUFA içeren fraksiyonların % 80 : 90 : 100'lük fraksiyonlar olduğu tespit edilmiştir ki; bu fraksiyonların en iyi morfofonksiyonel özelliğe sahip spermatozoalar olduğu gözlenmiştir. % 80 : 90 : 100'lük gruptan seçilen spermatozoalarla, % 40 : 50 : 70'lik gruptan seçilen spermatozoalar arasında C20:4 n6 ve C22:6 n3 konsantrasyonlarında ciddi bir farklılık gözlenmiştir. Adı geçen ilk grupta C20:4 n6 ve C22:6 n3 konsantrasyonu ortalama SD' sı % 5.2 ± 1.1 ve % 38.2 ± 2.2 iken, ikinci grupta bu rakamlar % 3.4 ± 1.6 ve % 11.5 ± 5.6 ölçülmüştür (yayımlanmamış veri). Bu sonuçlar göstermiştir ki; normal morfofonksiyona sahip spermatozoalarda diğer hücre membranlarına kıyasla en belirgin PUFA olan C22:6 n3 konsantrasyonu en yüksek düzeyde bulunmaktadır.

Bu deneysel veriler androlojik patolojilerde sperm membranındaki PUFA modifikasyonlarına bağlı olarak sperm membranının çok frajil hale geldiğini göstermektedir. Bu da, in-vivo olarak epididimal sıvının spermler için besleyici ve koruyucu bir rol oynamakla beraber; androlojik patolojilere bağlı anti/pro-oksidan dengenin bozulması ve/veya sperm membranı normalden farklı olarak frajil olduğu durumlarda spermler için zararlı bir ortama dönüşebileceğini göstermektedir. Tedavi sonrası elde edilen daha yüksek düzeydeki epididimal GSH seviyeleri ROS'a bağlı hasara karşı koruyucu rol oynamakta ve sperm membran PUFA düzeylerini, Percoll kriterleri ile seçilen normal morfolojik yapıya sahip spermatozoalarınki ile eşit seviyeye yaklaştırmaktadır.

Şu anda, GSH tedavisinin epididimal pasaj sırasında sperm hücrelerinin esansiyel yağ asidi desature edebilme kapasitesini arttırdığını ve in-vivo ya da in-vitro fertilizasyon kapasitesi için sperm membranındaki n3 PUFA yüzdesinin yüksekliğinin önemli olup olmadığını demonstre edebilmek en önemli iştir.

Tavsiye edilen kaynak: Lenzi A, et al: Hum Reprod 13: 1419-22.