SPERM DNA HASARLARININ PATOFİZYOLOJİSİ

KONUYLA İLGİLİ FİGÜRLER

SPERM DNA HASARLARININ HMG/FSH İLE TEDAİSİ

İnfertilite nedeniyle araştırılan çiftlerin yaklaşık %30'unda erkeğe ait bir faktör söz konusu olurken, %20'sinde de her iki eşe ait bir problem bulunmaktadır (FIVNAT 1996; Assisted reproductive technology in the United States and Canada 1998). Ancak, erkek faktörü infertilite tüm yönleriyle aydınlatılmış olmadığından, bunların çoğu idiyopatik oligoastenoteratozoospermi (OAT) grubu olarak kabul edilmektedir. Dolayısıyla tedavileri de her zaman tutarlı sonuçlar vermemektedir.

Diğer yandan, üremeye yardımcı teknikler (ÜYT), özellikle intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) son yıllarda sperm değerleri bozulmuş erkeklerde sıklıkla kullanılan bir uygulama haline gelmiştir. Buna rağmen olguların yaklaşık yarısında gebelik sağlanamamaktadır. Elde edilen sonuçlar fertilizasyon başarısızlığında %50 sperme ait bir faktörün rol oynayabileceğini önermektedir. Dolayısıyla, spermin kantitesinden çok kalitatif yapısının düzeltilmesi çalışmaları ön plana çıkmaktadır. Acosta ve ark. (1991, 1992)'nın; in vitro fertilizasyonda (IVF) FSH'nın fertilizasyon ve gebelik oranlarını artırdığını gösteren çalışmaları, bu konuda başka araştırmalara öncülük yapmıştır. Bunu takiben erkekte FSH kullanılmasının ICSI sonuçları üzerine etkisi prospektif, randomize, kontrollü bir çalışmada araştırılmış ve transfer başına embriyo kalitesi (ortalama 2.2'ye karşılık 1.6) ile implantasyon oranlarında (%15.5'e karşılık %6.5) anlamlı düzelme elde edilmiştir (Askhenazi 1999).

FSH'nın spermatogenezde etki mekanizması

FSH; sperm yapımında, maturasyonunda, spermatid nukleusu ve akrozomun morfogenezi ile spermiyogenez basamağında ve epididimal maturasyonda kardinal bir hormondur (Steinberger 1971; Courtens 1980). Hipogonadizim'de germ hücre ve yuvarlak spermatid sayılarını kantitatif olarak artırır (Van Alphen 1988). Aynı zamanda FSH'nın, hücre içinde anormal ultrastrüktüre sahip organel taşıyan sperm oranlarını azaltıcı, böylece sperm yapımında kalitatif bir düzelme yapıcı etkisi de bulunmaktadır (Bartoov 1994). Ancak, gonadotropinlerin idiyopatik OAT olgularında rolü tartışmalı olup, sonuçlar çelişkili çıkmıştır (Skakkebaek 1994; Nieschlag 2000). Burada FSH immünoreaktivitesi ve biyoaktivitesi arasındaki farklılığın (Schill 1995); FSH'nın izoformları arasındaki fizyolojik ve patolojik durumlara göre önemleri değişen heterojenitelerinin ya da erkekte gösterilen FSH veya FSH reseptör genlerine ait mutasyonların (Huhtaniemi 1998) etkin olması olasıdır. Diğer yandan, infertil erkeklerde özellikle sperm kromatin yapısındaki anormallik sıklığının arttığı gösterilmiştir (Irvine 2000; Zini 2001). FSH biyolojisi ve hedef organlar üzerine etkileri konusunda elimizdeki bilgiler, idiyopatik OAT olgularında dışarıdan FSH verilmesinin mantıklı bir yaklaşım olacağını önermektedir (Van Alphen 1988; Kula 1991).

Vücuttaki diğer dokuların kendilerine spesifik peptid-faktörleri olduğu gibi, FSH ve LH da gonadal hücrelere spesifik yaşamsal faktörler olarak görev yaparlar (Raff 1992). Gerçekten de, spermatogenez gonadotropin bağımlı olup, testislerin optimal fonksiyon görebilmeleri FSH ve LH tarafından desteklenmektedir (Parvinen 1982). Özellikle puberte sırasında spermatogenezin başlaması ve sürdürülmesinde FSH esas hormondur (Billig 1995). Erkekte germ hücrelerinin canlılığını sürdürebilmeleri, intratestiküler androjenlerin yanı sıra gonadotropinlerin varlığına da bağlıdır. Yapılan çalışmalar hipofizektominin ya da gonadotropinlerin bloke edilmelerinin germ hücrelerinde dejenerasyonu artırdığını ve testislerde somatik hücrelerin morfolojisini bozduğunu ortaya koymuştur (Madhwa 1976; Russel 1987; Ghosh 1992). FSH'nın immünonötralizasyonu ya da FSH reseptörlerinin blokajı yapıldığında da yine testis fonksiyonları bozulmakta, total sperm çıkışı azalarak infertilite görülmektedir (Moudgal 1997a)). İnsanda da benzer sonuçlar bildirilmiştir. FSH'nın immünonötralizasyonu yapıldığında sperm yapımı kalitatif ve kantitatif olarak bozulur (Moudgal 1997b). GnRH antagonistleri puberteyi geciktirmekte, erişkinlerde testis ağırlığını azaltarak fertiliteyi bozmaktadır (Kolho 1988). Her ne kadar Leydig hücreleri ve Sertoli hücreleri gelişimleri sırasında gonadotropinlere gereksinim göstermekteyseler de, erişkin hayvanlarda hipofizektomi bu hücrelerde apopitotik dejenerasyona neden olmamaktadır (Ghosh 1992; Billig 1995). Dolayısıyla, Leydig ve Sertoli hücreleri değil, sadece germ hücreleri gonadotropin eksikliğinde apopitoza uğramaktadırlar.

Diğer yandan, FSH immünnötralizasyonunun spermatogenezi etkilemeyeceği de bildirilmiştir (Dym 1979). Oysa hipofizektomi ile dolaşımdaki FSH elimine edildiğinde pakiten spermatositlerde ve belirli spermatid evrelerinde morfolojik olarak hücre dejenerasyonu ortaya çıkmaktadır (Russell 1977). Bu da, gonadotropinlerin testislerdeki etkilerinin değerlendirilmesinde, evreye spesifik etkileşimlerine dikkat edilmesi gereğini vurgulamaktadır.

Germ hücrelerindeki apopitozun serum FSH seviyesindeki azalma ile korele olup LH ile bir ilişki göstermemesi, bu hücrelerde yaşamsal hormon olarak FSH'nın etkin olduğunu, LH ve intratestiküler androjenlerin ise önemlerinin daha az bulunduğunu önermektedir (Billig 1995). Hipofizektomi yapılmış erişkinlerde, FSH'nın dejenere olmuş germ hücrelerinin sayısını azaltıcı biyolojik etkisi bulunmaktadır (Russell 1993). FSH bu etkisini hücrenin genomuna bağlanarak gerçekleştirir. Ancak FSH'nın bu etkisinde testosteronun da katkısı olabileceği konusunda bazı kanıtlar mevcuttur (Russell 1993). Hem FSH (cAMP bağımlı protein kinaz A aracılığıyla) hem de LH üzerinden testosteron (hücre içi androjen reseptörleri aracılığıyla), aynı mekanizmayla germ hücrelerinde genom uyarıcı etkilerini gösterirler. Bazı çalışmalar, FSH ve LH'nın birlikte kullanılmalarının, gonadotropin çekilmesine bağlı germ hücre dejenerasyonunu daha fazla azalttıklarını savunmaktadır (Russell 1993).

Sertoli hücreleri germ hücrelerine nutrisyonal destek sağlarlar. Bu işlevlerini gonadotropin ve androjen stimülasyonu altında gerçekleştirirler. Sertoli hücreleri membranlarında FSH, hücre içinde ise androjenler için reseptör taşırlar (Sar 1990; Heckert 1991). Ancak tam anlaşılamayan konu, gonadotropinlerin testislerde yeni oluşan hücre sayısını artırarak büyüme ve farklılaşmayı mı sağladıkları yoksa hücre ölümünü önleyerek yaşamlarını mı uzattıkları sorusudur. İkisinin de olabileceği yönünde kanıtlar vardır. FSH bir yandan spermatogenezin başlamasını ve sürdürülmesini sağlarken diğer yandan kromatin hasarlarını ve neticede apopitozu önleyerek hücrelerin canlılığını korumaktadır (Parvinen 1982; Tapanainen 1993).

Gonadotropin eksikliğinin spermatogenez üzerine etkisi apopitotik DNA kırıklarını artırarak olmaktadır (Sinha Hikim 1997). FSH'nın spermiyogenezde yaptığı düzeltici etkisinin kısmen bu mekanizmaya bağlı olması mümkündür. Testislerdeki hücre ölümünün, apopitozun bir göstergesi olan nukleozomlar arasındaki DNA kırıkları ile ilişkisini vurgulayan biyokimyasal kanıtlar da gösterilmiştir (Tapanainen 1993). Billig (1995); rat testisinde, GnRH antagonisti ile gonadotropin supresyonu yapıldığında apopitotik DNA hasarlarının yaşa bağımlı olarak arttığını bildirmiştir. Apopitoza uğrayan hücre tipini belirlemek amacıyla in situ analiz yapıldığında ise spermatositlerde DNA fragmentasyonunun artmış olduğu gözlemlenmiştir. Sonuçta erkekte germ hücrelerinde apopitozun başlatılmasını belirleyen 3 faktörün bulunduğu kanısına varılmıştır: 1) yaş; 2) özellikle FSH olmak üzere gonadotropin düzeyi; ve 3) seminifer epitel siklusunun evresi.

Aslında apopitoza bağlı germ hücrelerinin dejenerasyonu spermatogenez süreci içerisinde normalde de görülmektedir. Özellikle tip A spermatogoniumlarının mitoz bölünmeleri sırasında, spermatositlerin mayoz bölünmeleri sırasında ve spermiyogenezde (Huckins 1978; Kerr 1992). Ancak, gonadotropin eksikliği DNA'da gözlenen bu dejenerasyonu daha da artırmaktadır.

Gonadotropin tedavisi spermatogenez sırasında belirli evrelerde germ hücrelerindeki bu dejenerasyonları önlemektedir (Russell 1977). Gerçekten de, gonadotropinler ve seks steroidleri immatür rat testisinde yaşamsal faktörler olarak görev yapmakta olup, gonadotropin ve androjen tedavisi apopitoza bağlı DNA kırılmalarını önleyebilir (Tapanainen 1993). Hipofizektominin testisler üzerindeki dejeneratif etkisi, apopitoz yoluyla meydana gelmektedir. Hipofizektomi ya da GnRH antagonisti verilerek gonadotropin uyarımı ortadan kaldırılan ratlarda, testis ağırlıkları %25 azalırken, gerek interstisiyel hücrelerinde gerekse seminifer tubül hücrelerinde DNA parçalanmasında 4 kata varan artış ortaya çıkmaktadır (Tapanainen 1993). Oysa FSH verilmesini takiben testis ağırlıkları korunurken, apopitotik DNA parçalanması %90 önlenebilmektedir. Tek başına hCG'nin dejeneratif değişiklikleri önleyebilme potansiyeli FSH'dan oldukça düşük kalır. Başka çalışmalarda da FSH'nın spermatogonium ve pre-leptoten spermatositlerde Sertoli hücreleri üzerinden mitotik ve mayotik DNA yapımının uyarılmasında anahtar rol oynadığı gösterilmiştir (Marshall 1995; Anderson 1997). Bu sonuçlar da testislerde hücre ölümünün önlenmesinde FSH'nın etkili olduğunu önermektedir.

IVF'de en önemli fertilizasyon yetmezliği nedenleri sperm morfoloji bozuklukları ile spermin zona pellusidaya bağlanmasındaki defektlerdir. Kromatinin maturasyonu ve DNA yapısı da normal fertilizasyon potansiyelini yakından ilgilendiren faktörlerdir (Menezo 1995). Sperm genomuna ait hasarlar spermiasyon ve kromatin kondensasyonunda bozukluklardan kaynaklanabilir, bu da neticede embriyo kaybı ve mortaliteye yol açabilir (Plachot 1992). Bu veriler insanda preimplantasyon embriyo gelişiminde ve blastosist oluşumunda kuvvetli bir paternal etkinin varlığına işaret etmektedir.

FSH tedavisinin sperm kromatin hasarları üzerine etkisi

İnfertil erkeklerde FSH tedavisinin sperm genetik yapısında morfolojik bozuklukları azaltıcı etkisi bulunduğu ultrastrüktürel çalışmalarda ortaya konmuştur. Ben-Rafael (2000), erkekte FSH tedavisinin fertilizasyon oranlarını artırıcı etkisini spermin subsellüler komponentlerindeki düzelmeye bağlamaktadır. Prospektif, randomize, crossover planlanan çalışmalarında, normogonadotropik erkeklerde 60 gün boyunca günde 75 IU pürFSH kullanarak normal yapıdaki sperm nukleus oranının elektron-mikroskopik düzeyde %17'den %36'ya çıktığını gözlemlemişlerdir (p<0.1). Olguların %60'ında nukleus yapısında anlamlı düzelme görülmüştür. Neticede, fertilizasyon oranlarında kontrol ile karşılaştırıldığında anlamlı artış belirlenmiştir (%5'e karşılık %19; p<0.05). Benzer şekilde Foresta ve ark. da (1998) idiyopatik OAT bulunan erkeklerde rekombinan-FSH'nın spermatogenezi ve spermatogonium populasyonunu artırdığını bildirmişlerdir.

OAT olgularında FSH'nın sperm kromatin yapısında anlamlı düzelme sağladığı diğer çalışmalarda da ortaya konmuştur. Uzun süreli (6 ay) 150 IU pürFSH'nın günaşırı kullanımı ile dismorfik baş anomalisi oranlarında %21.2'den %14.6'ya (p<0.001) ve akrozom+kromatin+yuvarlak baş anomalilerinde %34.7'den %27.2'ye (p<0.001) düşme izlenmektedir (Arnaldi 2000). Kamischke (1998); günde 150 IU rekombinan-FSH'nın 12 hafta kullanımını takiben haploid germ hücrelerinde kromatin kondensasyonunda anlamlı artış geliştiğini göstermiştir. Baccetti (1997)'nin serisinde de; aynı doz ve sürede FSH verilen infertil erkeklerde kromatin kondensasyonunu tamamlamış spermatozoa oranı %22'den %59'a çıkmıştır. FSH'ya yanıt alınan olguların yaklaşık üçte birinde de klinik gebelik elde edilmiştir.

Strehler (1997), idiyopatik OAT bulunan erkeklerde günde 150 IU pürFSH'yı 12 hafta süreyle kullanmış ve bu sürenin hemen sonunda elektron mikroskopik olarak ultrastrüktürel matematik analiz yaptığında, normal nukleus şekli (%25'e karşılık %34) ile kondanse olmuş, kompakt kromatin (%35'e karşılık %49) oranlarında anlamlı düzelme elde etmiştir. Ancak tedavinin kesilmesini takiben 6 hafta sonra yapılan incelemelerde anlamlı bir düzelmenin kalmamış olması, FSH'nın kullanıldığı süre içerisinde kromatin ve nukleus üzerine etkisinin devam ettiğini düşündürmektedir. O halde, pürFSH OAT'li infertil olgularda sperm kalitesini düzeltmek amacıyla kullanılabilir özellikte bir tedavidir. Gerçekten de, Acosta'nın (1991, 1992) IVF öncesi FSH kullanılan erkeklerde spermde kantitatif bir düzelme olmaksızın, fertilizasyon ve gebelik oranlarında anlamlı bir artış olacağını gösteren bulguları da FSH'nın sperm genomu üzerine önemli etkisi bulunacağını destekler niteliktedir. Acosta, FSH tedavisinin Sertoli hücrelerinin FSH-bağımlı fonksiyonunu etkileyerek spermatogenezin kalitesini, neticede sperm-oosit etkileşimini düzelttiğini önermiştir. Strehler ise bu düzelmenin ultrastrüktürel düzeyde sperm kromatinine ait olduğunu göstermiştir. Benzer bulgular diğer araştırıcılar tarafından da bildirilmiştir (Bartoov 1994). Gerçekten de, spermin ışık mikroskopik analizi her zaman gerçek fonksiyonu konusunda yeterli bilgi vermemektedir (Zamboni 1987; Baccetti 1995; Bartoov 1994; Ben-Rafael 2000).

FSH tedavisi için hasta seçim kriterleri

Sperm parametreleri bozulmuş infertil erkeklerde FSH kullanılması, yukarıda açıklanan nedenlerden dolayı faydalı bir uygulama olarak görülmektedir. Ama diğer bazı çalışmalar ise bunu desteklememektedir. FSH tedavisinin etkisinin net olarak gösterilememiş olmasının iki nedeni olabilir: 1) çalışmaların çoğu kontrollü yapılmamışlardır; 2) OAT seminifer epitelde ortaya çıkabilecek ve değişik evrelerdeki maturasyon anomalilerini de içeren çok sayıdaki değişikliklerin en son evresini temsil etmektedir. FSH bu değişikliklerin sadece bazılarını tedavi edici etkiye sahip olabilir. Oysa çoğu çalışma bunu gözardı ederek, seçilmemiş hasta gruplarında sadece en son evre olan ejakulattaki sperm parametrelerini, örneğin OAT durumunu analiz ederek bir kanıya varmaya çalışmaktadır. Plasebo kontrollü, randomize, çift-kör bir çalışmada FSH'nın sperm parametreleri üzerine bir etkisi bulunmadığı bildirilmiş olmakla beraber, aynı çalışmada hastaların testis volümlerinde anlamlı artış saptanmıştır (Kamischke 1998). Oysa bu bulgu FSH'nın spermatogenezde yaptığı stimülasyona bağlı olabilir. Gerçekten de Foresta (2002); FSH'nın insanda spermatogonium ve spermatosit popülasyonunu artırdığını göstermiştir. Demekki, sperm maturasyonunda bir anormalliğin bulunmadığı olgular seçilse, önceki çalışmada bu artış ejakulattaki sperm değerlerine de yansıyabilecek idi.

FSH tedavisine yeterli yanıtın alınması için belirli hasta seçim kriterleri önerilmektedir. Foresta (2000); FSH'nın erkekte etkili olduğu grubun serum FSH ve inhibin B seviyeleri normal, testis dokusunun maturasyon duraklaması göstermediği hipospermatogenezli olgular olduğunu göstermiştir. FSH'nın sperm maturasyonu üzerine etkili olması, spermatogenezin mikro-çevresel koşulları üzerine olan olumlu etkisine bağlanabilir. Ancak burada seminifer tubüllerin, özellikle Sertoli hücre fonksiyonlarının sağlam olması ön koşuldur. Gerçekten de spermatogenezin erken evrelerde duraklamış olduğu olgularda FSH'nın etkisinin kaybolduğu gözlenmektedir (Foresta 1998). Benzer şekilde, ancak Sertoli hücrelerinin stimüle edildiklerinde inhibin B salgılamalarının belirli bir oranı aştığı durumlarda FSH ile yeterli yanıt alınabileceği de bildirilmektedir (Kapolla 2000). Glander ise (1997); erkeklerde FSH tedavisine başlanılmadan önce GnRH stimülasyon testi yapılmasını, sonuçta FSH-stimülasyon faktörünün <1.7 bulunduğu olgularda FSH kullanılmasının etkili olacağını önermektedir. Namiki (1986); testislerde FSH reseptörlerinin varlığının önemine dikkat çekerek, Johnsen skoru yükseldikçe daha çok olguda HMG tedavisine yanıt alındığını vurgulamıştır. Baccetti (1997); antisperm antikor, enfeksiyon, maturasyon duraklaması ya da genetik defekt bulunan erkeklerde FSH yanıtının yetersiz kalacağını, oysa apopitotik veya immatür germ hücrelerinin varlığında seminal parametrelerde ve klinik sonuçlarda anlamlı düzelme elde edilebileceğini göstermiştir.

FSH tedavisinde doz ve süre

FSH'nın bio-efektif yarılanma ömrü 13.4-28 saattir (Jockenhovel 1990; Out 1996). 24 saat aralıklarla verildiği zaman serum düzeyi bazal değerin %50 üzerine çıkmaktadır. İlk 72 saatin sonunda sabit bir seviyeye erişerek, her dozu takiben ±%20 değişikliklerle bu seviyesini tedavi boyunca devam ettirir (Ben-Rafael 2000). Ancak, tedavinin kesilmesini takiben serum düzeyi de düşüşe geçer. Tedavinin kesilmesini takiben serumdaki düzeyinin bazal değere inişi için gerekli süre ise kesin olarak ortaya konmuş değildir. Doz olarak da günlük 75 IU kullanımının sperm ultrastrüktüründe ve fertilizasyon oranlarında düzelme yapması için yeterli olduğu savunulmakla birlikte (Ben-Rafael 2000), 100 (Foresta 2002) ve 150 IU (Strehler 1997) kullanımının gerekli olduğunu bildiren araştırıcılar da vardır.

FSH uygulanımlarının doz aralıkları konusunda kesin bir görüş yoktur. Günlük 75IU ve 150IU kullanılması arasında bir fark bulunmazken (Ben-Rafael 2000), haftada 3 kez 100 IU (Foresta 2002) veya 150IU'nin (Acosta 1992) de yeterli olabileceği gösterilmiştir. Gün aşırı 50IU rekombinan-FSH ise yetersiz bulunmuştur (Foresta 2002). Bartoov (1994) spermiyogenez ve epididimal maturasyon bozukluklarının düzeltilmesinde 30 günlük tedaviyi yeterli bulurken, Ashkenazi (1999) daha erken spermatogenez evrelerinin düzenlenmesi için >50 gün'lük uygulamaları önermektedir.

Sonuç olarak; IVF-ICSI'ye alınan infertil çiftlerde adjuvan olarak erkekte FSH kullanılması faydalı görülmektedir. Bu görüş, ICSI döneminde şiddetli erkek faktörü bulunan çiftlerde erkeğin tedavisine gerek bulunmadığı görüşüne ters düşmektedir. Oysa FSH tedavisi, embriyo gelişimi üzerinde olası paternal etkiyi minimale indirebilecek kapasitede özelliğe sahip olduğu kanısı vermektedir. Ancak bu özelliğin ispatlanabilmesi için daha geniş seriler ile yapılacak araştırmalara ihtiyaç bulunmaktadır.

KAYNAKLAR